Трансген c-myc: связь с лимфомогенезом
Ряд интересных данных относительно молекулярных механизмов злокачественного перерождения клеток и, в частности, лимфомогенеза удалось получить в последние годы благодаря использованию в качестве модели трансгенных животных, в первую очередь трансгенных мышей (см. Adams, Cory, 1991 ). Классификация лимфом, возникающих у мышей, дана Паттенгале и Тейлором ( Pattengale, Taylor, 1983 ).
Моделирование различных типов злокачественных лимфом с использованием трансгенных мышей было начато еще в 1985 г. Адамс с соавт. ( Adams et al., 1985 ; Langdon et al., 1986 ) осуществили первые эксперименты, в ходе которых были получены животные с геном c-myc , находящимся под контролем различных промоторов. Только у трансгенных мышей с энхансерами Ig -генов мю (mu) и каппа (k) образовывались лимфомы (в среднем через 11 и 23 недели соответственно). Возникающая патология классифицирована авторами как мультицентрическая лимфосаркома (рассеянная лимфома) в сочетании с лейкемией. Установлено также, что это В-клеточная лимфома , поскольку в опухолевых клетках наблюдали экспрессию каппа-локуса Ig (в Т-клетках он не экспрессируется). Возникающие опухоли характеризовались поликлональной гиперплазией пре-В-клеток, которая со временем прогрессировала в моноклональную злокачественность. В результате негативного контроля собственный ген c-myc у трансгенных мышей оказался репрессированным. Поэтому сделан вывод о том, что конститутивная экспрессия трансгена c-myc , уровень которой хоть и не очень значительный ( Alexander et al., 1987 ), является причиной наблюдаемых биологических изменений.
Харрис с соавт. ( Harris et al., 1988 ) при введении в мышей гена Emu-c-myc обнаружили почти в 100% случаев развитие клональных В-лимфоидных опухолей. Ими, как и в ранее проведенных работах, установлено, что у всех 50 проанализированных трансгенных животных опухоли имеют В-клеточное происхождение: развиваются преимущественно пре-В- клеточные лимфомы. Полученные результаты согласуются с предположением о том, что уровень экспрессии гена c-myc является круциальным фактором во время онтогенеза и роста клеток, определяющим внутри определенной линии клеток выбор между клеточной пролиферацией или дифференцировкой к терминальной стадии ( Adams et al., 1985 ).
У трансгенных мышей с геном c-myc человека, в первый интрон которого вставлен энхансер гена тяжелой цепи Ig мыши, экспрессия рекомбинантного трансгена происходила преимущественно в пре-В-клетках. В результате у животных, развивались главным образом лимфобластические лимфомы пре-В типа ( Schmidt et al., 1988 ). Культивируемые предшественника трансгенных В-лимфоцитов продемонстрировали преимущество в росте над нетрансгенными В-клетками.
Тем не менее, несмотря на экспрессию гена c-myc в линии В-клеток у трансгенных животных начиная с их раннего возраста (Langdon et al., 1986 ; Alexander et al., 1987 ), которая усиливает активность клеточного цикла, лимфоидные клетки молодых трансгенных мышей не являются злокачественными ( Langdon et al., 1986 ; Langdon et al., 1988 ), потому что для их трансформации требуются генетические изменения. Повышенная активность клеточного цикла и большая доля ранних В-лимфоидных клеток в предопухолевых мышах с геном Em-myc указывают на то, что ген myc определяет преимущество самовозобновления над дифференцировкой ( Langdon et al., 1986 ).
Интересен результат, полученный Клинкеном с соав. ( Klinken et al., 1988 ) при введении в линии лимфомных клеток, полученных из трансгенных мышей с c-myc , гена v-raf . При одновременном действии c-myc и v-raf происходило переключение в сторону миелоидных линий, что, по мнению авторов, свидетельствует о генетическом репрограммировании в лимфоцитах при одновременным действием этой пары онкогенов. Лимфомагенез у трансгенных мышей с геном c-myc может быть связан также и с появлением мутаций в гене ras ( Alexander et al., 1989b ).
Александер с соавт. ( Alexander et al., 1989a ; Alexander et al., 1989b ) показали, что хотя у трансгенных мышей с геном c-myc под контролем энхансера гена Ig ( Emu ) часто развивались В-лимфоидные опухоли, клетки из пренеопластического костного мозга не вызывают опухоли у контрольных мышей. Если же эти клетки инфицировали ретровирусами с v-Ha-ras или v-raf , то это способствовало автономной пролиферации и туморогенности пре-В-лимфоидных клеток.
Эксперименты с лимфоидными клетками in vitro в дальнейшем были продолжены на трансгенных животных. Лангдон с соавт. ( Langdon et al., 1989 ) инфицировали неонатальных Emu-myc трансгенных мышей ретровирусами, содержащими онкогены v-Ha-ras , v-raf , or v-abl . В случае первых двух онкогенов происходило усиление В-лимфоидного туморогенеза. Лимфобластические пре-В-лимфомы возникали значительно быстрее при кооперативном действии гена c-myc с генами v-Ha-ras или v-raf .
Инбредные линии позволяют тестировать модулирует ли генетический статус предрасположенность к опухолям. При введении конструкта Emu-myc и его экспрессии в В- и Т-клетках трансгенных животных у мышей C57BL/6 развивались преимущественно В-лимфомы, а у мышей C3H/HeJ - Т-лимфомы ( Yukawa et al., 1989 ).
Результаты, полученные двумя выше указанными группами авторов, не исключали возможности того, что еще какие-то онкогены участвуют в возникновении В-лимфом у трансгенных мышей с Emu-myc . Новые онкогены, кооперативно действующие с c-myc при трансформации В-клеток, были выявлены при анализе мест интеграции провируса Mo-MuLV у трансгенных мышей с Emu-myc ( van Lohuizen et al., 1991 ; Haupt et al., 1991 ). Как уже указывалось выше, при инфицировании мышей Mo-MuLV у них возникают Т-клеточные лимфомы и происходит активация генов c-myc , N-myc и pim-1 . Однако при инфицировании этим вирусом трансгенных мышей, содержащих Emu-myc , возникали В-клеточные лимфомы, в которых провирус обнаруживался преимущественно как в известных ранее локусах pim-1 и pim-2 , так и в неизвестных локусах bmi-1 , pal-1 , bla-1 и emi-1 . Анализ структуры вновь выявленных мест интеграции провируса показал, что по крайней мере в одном из них ( bmi-1 ) содержится онкоген. bmi-1 кодирует Zn finger белок, который представляет собой, по-видимому, регулятор транскрипции ( van Lohuizen et al., 1991 ; Haupt et al., 1991 ). Таким образом, полученные данные позволяют считать, что по крайней мере 6 генов (локусов) могут кооперировать с геном c-myc , вызывая ускорение образования В-лимфоидных опухолей. Причем, по-видимому, трубуется более, чем один ген, дополнительно к конститутивно экспрессирующемуся гену c-myc , чтобы вызвать ( Haupt et al., 1991 ). Наиболее эффективным онкогенным партнером c-myc является ген bmi-1 , который не изменяет свою структуру в результате внедрения провируса, а усиливает свою экспрессию за счет этого внедрения.
В таблице суммированы имеющиеся данные, полученные на модели трансгенных животных, которые свидетельствую о существовании кооперации разных онкогенов с геном myc . Видно, что здесь имеет место исключение из общего правила, гласящего, что ядерный онкобелок кооперирует с цитоплазматическим онкобелком ( Weinberg, 1989 ).
Нуссенцвейга с соавт. ( Nussenzweig et al., 1988 ) получали наряду с трансгенными мышами, содержащими только c-myc человека под контролем энхансера Ig-ген а, еще двойных трансгенных животных, несущих одновременно или ген myc и ген секретируемого IgM , или ген myc и ген мембранносвязанного IgM ( mIgM ). В последнем случае было обнаружено, что происходит сильная супрессия лимфом у мышей. У двойных трансгенных животных менялся и фенотип. Если у мышей только с геном myc преимущественно встречались лимфомы пре-В-клеток, относящиеся к типу лимфобластических лимфом, то у двойных трансгенных животных с геном mIgM появлялись лимфомы про-В-клеток, а также пре- В-, В-, Null-клеток и даже в небольшом количестве Т-клеток. Кроме того, у последних чаще возникали лимфомы центральных фолликулярных клеток и иммунобластические лимфомы. Анализ причин, обусловливающих такой эффект, позволил авторам заключить, что в данном случае отсутствует влияние иммунной системы и скорее всего причиной супрессии является физиологическое изменение пре-В-клеток под влиянием mIgM , в результате которого ускоряется развитие пре-В-клеток и уменьшается интервал времени действия онкогена c-myc .
Исследование трансгенных мышей с химерным геном H-2K/c-myc , который экспрессировался не только в В-клетках, но и в друхих типах клеток за счет наличия вездесущего промотора, показало, что у таких животных также может развиться лимфопролиферативный синдром ( Morello et al., 1989 ). В В-клетках происходила экспрессия не только экзогенного, но и эндогенного гена c-myc . У одной из трансгенных мышей тимус а также лимфоузлы сильно инфильтрированы В-клетками. Однако у других животных, даже с более высоким уровнем экспрессии трансгена c-myc , никаких патологий не наблюдали на протяжении 20 месяцев. Авторы приходят к выводу о том, что длительная экспрессия c-myc может нарушать нормальное развитие лимфоцитов, но не ведет прямо к злокачественности. В пользу этого свитетельствуют и данные, полученные на трансгенных кроликах с подобными трансгенами ( Knight et al., 1988 ). Оказалось, что у них развивается не лимфома , а лейкоцитная лейкемия . Причем заболевание возникало очень рано при развитии животных (на 17-12 день) и имело олигоклональное происхождение. Из этих данных следует естественное предположение о наличие "вторичного сигнала", участвующего в развитии злокачественности, который отличается у мышей и кроликов и в сочетании с геном Emu-myc приводит, соответственно, к моноклональным лимфомам или олигоклональным лейкемиям.
У трансгенных мышей с другим членом семейства myc (трансген Emu-N-myc ) также развивались преимущественно В-клеточные лимфомы ( Dildrop et al., 1989 ; Rosenbaum et al., 1989 ). В природе этот ген обычно не участвует в развитии В-лимфоидной злокачественности. Активация N-myc была выявлена только в Т-клеточных лимфомах, индуцированных инсерцией Мо-МuLV ( Dolcetti et al., 1989 ). Однако в такой искусственной системе как трансгенные мыши ген N-myc при наличие специфического для В-клеток промотора вызывает, как и ген c-myc , В-клеточную лимфому. Картина развития заболевания напоминает при этом ту же, что и при введении мышам гена c-myc c энхансером Emu . На первом этапе наблюдается лимфопролиферативный синдром, при котором пре-В- клетки накапливаются в костном мозге и в меньшей степени в селезенке. Затем у трансгенных животных развивается клональная злокачественность В-клеток, вероятно за счет генетических изменений в единичном члене циркулирующей пренеопластической популяции ( Rosenbaum et al., 1989 ). В то же время у трансгенных животных с мышиным конструктом Emu-L-myc ( Moroy et al., 1990 ) наблюдали появление преимущественно (в 7 случаях из 11) Т-клеточных лимфом. При этом онкогенный потенциал L-myc был заметно слабее, чем у других членов данного семейства генов. Преимущественное действие в этом случае трансгена на Т-клетки объясняется, по-видимому, сильной его экспрессией именно в Т-клетках, но не в пролифирирующих В-клетках и костном мозге. Последнее скорее всего связано со специфическим регуляторным элементом, содержащимся в гене L-myc и действующим кооперативно с Emu . У трансгенных мышей с высокоэкспрессирующимся экзогенным N-myc происходит подавление экспрессии эндогенных генов N-myc и c-myc ( Dildrop et al., 1989 ; Rosenbaum et al., 1989 ; Ma et al., 1991 ). Как показало специально проведенное исследование ( Ma et al., 1991 ), подавление экспрессии эндогенных генов связано не только с высоким уровнем экспрессии трансгена. Однако детально этот эффект пока не изучен. При анализе В-клеточных линий, полученных из клеток трансгенных мышей с Emu-N-myc , было обнаружено, что в них одновременно происходит синтез sIgM и набора генов, который в норме экспрессируется только в пре-В- клетках ( Ma et al., 1992 ). В частности, в этих клетках происходил синтез белков, кодируемых активирующими рекомбиназу генами (recombinase activating genes, RAG-1 и RAG-2 ). Интересно, что регуляция экспрессии генов RAG-1 и RAG-2 осуществлялась за счет действия sIgM .
У трансгенных мышей с рекомбинантным геном c-myc и промотором LTR MMTV ( Leder et al., 1986 ) около 1/2 всех возникающих опухолей представляли собой лимфомы В- и Т-клеток. Основную массу составляли лимфомы лимфобластического типа, происходящие из B, T, или non-B, non-T клеток. Встречались также лимфомы иммунобластического и фолликулярного типа. В этой связи интересно отметить, что лимфомы В- и Т-типа возникают и у трансгенных мышей с онкогеном c-erbB2 , когда он находится под контролем LTR MMTV ( Suda et al., 1990 ).
Как показали эксперименты на трансгенных мышах, в LTR MMTV имеется негативный регуляторный элемент ( Ross et al., 1990 ). Учитывая, что в Т-клеточных лимфомах имееют место делеции в LTR (см. ранее), можно было бы думать о взаимосвязи между этими делециями и эффективонстью транскрипции MMTV в Т-клетках. Однако, согласно данным, полученным Россом с соавт., LTR , выделенный из MMTV из клеток Т- лимфомы, не является специфическим для Т-клеток. Следовательно, какие-то другие элементы провируса или какие-то дополнительные события необходимы для индукции лимфом вирусом MMTV .
