ДНК-полимераза йота: биохимические свойства полимеразы in vitro
Благодаря особому строению каталитического центра Pol йота обладает набором необычных свойств. Прежде всего, фермент использует не комплементарное Уотсон-Криковское, а Хугстиновское взаимодействие . Соласно данным рентгеноструктурного анализа, активный сайт Pol йота значительно отличается от каталитических центров других склонных к ошибкам ДНК-полимераз Y-семейства и является уникальным. Прежде всего, он содержит крупные алифатические аминокислотные остатки, которые мешают одному из нуклеотидов (матричному или встраивающемуся) принять обычную при образовании Уотсон-Криковского взаимодействия антиконформацию. Нуклеотид разворачивается на 180 градусов, принимая противоположную ориентацию - син-конформацию. При этом между нуклеотидами образуются Хугстиновские водородные связи ( Prakash, 2005 ), ( рис. 3 ).
С одной стороны Pol йота человека способна выполнять некоторые функции, направленные на сохранение стабильности генома. Например, фермент способен удалять фосфат дезоксирибозы (5'дезоксирибофосфатлиазная активность), что необходимо для правильного восстановления поврежденного участка ДНК при ЭРО . Показано, что Pol йота может участвовать в этом процессе вместе с одним из основных участников ЭРО - Pol бета , высоко экспрессирующейся в головном мозге [ Bebenek, 2001 ].
Следует отметить, что при репликации незначительно модифицированных нуклеотидов, напротив которых обычные репликативные ДНК-полимеразы встраивают некорректный нуклеотид, (некомплементарный первоначальному неповрежденному), Pol йота, "ошибаясь", встаивают нужный нуклеотид, предотвращая тем самым транзиции и транслокации. Так, например, Pol йота включает напротив 8-оксогуанина цитозин. Pol йота способна также встраивать гуанин напротив урацила, что может быть использовано клеткой для предотвращения транзиций, вызываемых дезаминированием цитозина [ Vaisman, 2001 ; Vaisman, 2006 ].
Наконец, фермент способен вести синтез напротив целого ряда повреждений, блокирующих работу высокоточных репликативных ДНК- полимераз, с различной эффективностью и степенью корректности: AII- сайты, 3'-T положение (6-4)-Т-Т фотопродуктов, T-U циклобутановые димеры, бензо(альфа)пуреновые аддукты аденина, N-2 аддукты гуанина (8-гидрокси-1 N-2-пропанодезоксигуанозин, транс-4-гидрокси-2-ноненалдезоксигуанизин, N-2 метилдезоксигуанозин, N-2 этилдезоксигуанозин, N-2 бензилдезоксигуанозин, N-2 изобутилдезоксигуанозин) ( Johnson, 2000 ; Tissier, 2000 ; Frank, 2002 ; Washington, 2004 ; Choi, 2006 ; Vaisman, 2006 ; Wolfle, 2006 ). Например, in vivo в результате окисления липидов и полиаминов образуется соединение акролеин , являющееся мутагеном и способствующее образованию N-2 аддуктов гуанина, в частности, гамма-гидрокси-1,N-2- пропанодезоксигуанозин (гаммаГОПдГ). Эти поврежденные основания не способны участвовать в образовании Уотсон-Криковских связей с комплементарным цитозином. На помощь в запуске остановленной репликации приходит Pol йота, которая встраивает напротив повреждения цитозин, используя Хугстиновское взаимодействие [ Weisenseel, 2002 ].
Но, с другой стороны, Pol йота обладает самой низкой точностью синтеза неповрежденной ДНК среди всех известных на сегодняшний день склонных к ошибкам ДНК-полимераз [ McDonald, 2001 ]. При этом включение напротив четырех оснований ДНК происходит с различной точностью и эффективностью.
Частота ошибок напротив гуанина и цитозина составляет от одной тысячной до одной десятой. Наиболее корректно фермент копирует аденин, чатота ошибок - от одной стотысячной до одной тысячной, но при этом все равно использует не Уотсон-Криковское, а Хугстиновское взаимодействие [ Haracska, 2001 ; Johnson, 2000 ; Washington, 2004 ; Prakash, 2005 ]. Напротив тимина матрицы фермент демонстрирует самое удивительное поведение - встраивает dGTP (по тому же механизму, что и напротив урацила) в несколько раз эффективнее (от 3 до 11 раз), чем канонический dATP [ Zhang, 2000 ; Tissier, 2000 ], ( рис.4 , рис.5 ).
Таким образом, степень точности фермента на неповрежденной ДНК в зависимости от состава матрицы может варьировать до 100000 раз. В результате репликация с участием Pol йота должна приводить к низкой частоте мутаций тимина и высокой частоте мутаций аденина. Такую репликацию назвали "асимметричной мутацией".
После встраивания одного (иногда нескольких) нуклеотидов в растущую цепь Pol йота неспособна продолжать репликацию ( Zhang, 2000 ; Tissier, 2000 ). Очевидно, что такая дистрибутивность - это защита клетки, ограничивающая участие фермента в репликации геномной ДНК.
Последние исследования выявили и другое необычное свойство Рol йота: в отличие от большинства известных высокоточных и высокоошибочных ДНК-полимераз фермент в качестве основного кофактора утилизирует in vitro в ходе ДНК-полимеразной реакции (и, вероятно, in vivo) ионы марганца, а не магния. Использование низких концентраций ионов марганца (0,05-0,25 mM) в экспериментах in vitro повышает активность Рol йота в зависимости от типа субстратата от 23 до 65 раз по сравнению с использованием в качестве основного кофактора ДНК-полимеразной реакции катионов магния в концентрации 5mM ( Frank, 2007 ). Кроме Рol йота эффективно утилизировать ионы марганца способны склонные к ошибкам ДНК-полимеразы Х-семейства Pol лямбда и Pol бета ( Blanca, 2003 ; Maga, 2006 ; Wang, 1977 ).
Известно, что свойства склонных к ошибкам ДНК-полимераз в пределах данной таксономической группы у представителей разных классов, у которых найдена та или иная ДНК-полимераза, как правило, схожи. Pol йота в этом плане также представляет собой исключение.
Так, фермент плодовой мушки дрозофилы более схож по своим свойствам с Рol эта человека или дрожжей, нежели с человеческой Рol йота. Свойства ДНК-полимераз насекомых и млекопитающих сильно отличаются по способности и эффективности вести репликацию тех или иных повреждений ДНК. Рol йота дрозофилы, как и Рol эта эукариот, точна и эффективна на Т-Т циклобутановых димерах, а Рol йота человека ошибочна и неэффективна [ Ishikava, 2001 ; Johnson, 2000 ; Vaisman, 2002 ]. Однако, данные о поведении и свойствах Рol йота у других представителей позвоночных и беспозвоночных животных на сегодняший день отсутствуют, хотя последовательность генов ДНК-полимеразы расшифрована у многих организмов [ Vaisman, 2002 ].
