Альтернативные варианты агезии в движущихся клетках
Итак, какой тип адгезионной динамики демонстрируют движущиеся клетки? Первые, пионерские исследования динамики формирования молекулярных компонент адгезионных структур, обеспечивающих адгезию к субстрату у живых клеток, были ограничены наблюдениями наиболее явных фокальных контактов [ Meigs, ea 1986 ]. В последние годы изобретение более чувствительных камер, также как и новых флуоресцентных аналогов адгезионных компонент открыли пути осуществления нового более глубокого анализа причин и хода образования адгезионных структур [ Anderson, ea, 2000 , Rottner, K., ea, 1999 , Rottner, ea 2001 , Kaverina, ea 1998 , Kaverina, ea 1999 , Kaverina, ea, 2000 , Smilenov, ea 1999 , Laukaitis, ea, 2001 , Beningo, ea 2001 , Riveline, ea, 2001 , Edlund, ea 2001 ]. Для удобства, мы будем иллюстрировать различия в адгезионной динамике в процессе движения клеток сравнением особенностей процесса в трех различных типах клеток ( Рис. 2 , рис 3 , рис 4 ). Первый пример это эпидермальные каратоциты выделенные из амфибий или рыб ( Рис. 2 ), которые на настоящий момент ставят рекорды по скорости основанной на актине подвижности в 20 микрон/мин. Здесь мы получаем сведения о минимальных условиях необходимых для движения клеток: наличие широких ламеллиподий (с отсутствием микровыростов) на переднем крае клетки и латеральным расположением одного или большего числа актиновых пучков на заднем крае клетки. Цитопласты спонтанно образовавшиеся из этих клеток [ Euteneuer, ea 1984 ] или выращенные экспериментально [ Verkhovsky, ea, 1999 ] двигаются с той же скоростью как и родительские клетки, обладающие такой же организацией цитоскелета [ Verkhovsky, ea, 1999 ]. Адгезионная динамика в кератоцитах была визуализирована путем одновременного наблюдения клеток с инжектированным связывающимся с родамином винкулином при помощи IRM и конфокальной флуоресцентной микроскопии [ Anderson, ea, 2000 ]. Поскольку кератоциты перемещаются на расстояние порядка размера клетки примерно за две минуты (это занимает около одного часа для фибробластов), максимальное время жизни точек адгезии очень короткое и ограничено этим временем. Точки адгезии, распознаваемые по аккумуляции винкулина, наблюдаются как маленькие, точечные "фокальные комплексы" расположенные позади переднего фронта ламеллиподии и под актиновой сеткой. Винкулин , бета 1 интегрин , альфа-актинин и FAK были локализованы в этих комплексах методом иммуномаркинга [ Lee, ea 1997 ]. Судьба фокальных комплексов в кератоцитах зависит от того, возникают ли они в центральной зоне, на переднем крае тела клетки или на флангах. В центральной зоне фокальные комплексы остаются в стабильном положении относительно субстрата и или рабираются под телом клетки когда она перемещается над ними, или отрываются от субстрата, когда задний край клетки проходит над ними [ Anderson, ea, 2000 , Anderson, ea 1996 ]. В области ламеллиподии на флангах тела клетки фокальные комплексы не растворяются, а сливаются вместе на заднем конце образуя более крупные адгезионные зоны, напоминающие фокальные адгезии. Эти латеральные адгезии не стационарны, короткоживущи и склонны к перемещению к флангам тела клетки скользящим движением, обусловленным сократимостью латерально организованных пучков активных филаментов [ Anderson, ea 1996 , Lee, ea 1994 ]. Предоставляя наиболее непосредственный пример организации перестройки точек адгезии, приводимый пример кероцитов отвечает на вопрос играют ли какую-нибудь положительную роль в движении задние, латеральные точки адгезии. Действительно, они нужны, так как без них латеральное напряжение необходимое для перемещения тела клетки [ Anderson, ea 1996 , Lee, ea 1994 , Svitkina, ea 1998 ] не могло бы развиться.
В качестве второго примера мы взяли клетки мышиной меланомы B16 которые могут формировать ламеллиподию непрерывно со скоростью порядка 2 микрон в минуту и спорадически до 4 микрон в минуту, когда посажены на подложку из ламинина [ Ballestrem, ea, 1998 , Ballestrem, ea, 2000 , Rottner, ea 1999 ].
В таких подвижных клетках ламеллиподии в основном построены из актиновой сети и в них проявляются пучки микровыростов, демонстрирующие быструю латеральную подвижность [ Rottner, ea 2001 ]. В клетках B16 (измененных) обработанных GEF-VASP видно, что маленькие, удлиненные фокальные комплексы образуются друг за другом в основании ламеллиподии ( Рис. 3 ). Они живут недолго, существуя около 1 минуты. (Рис.3, K.Rotter, частное сообщение) и заменяются новой сетью фокальных комплексов по мере продвижения ламеллиподии [ Rottner, ea 1999 ]. Таким образом видно, что существует актиновый "круговорот" фокальных комплексов в структуре ламеллиподии по мере ее перемещения. В некоторых случаях индивидуальные фокальные комплексы могут сохраняться после того как ламеллиподии продвинулись за них и перерастать в более долгоживущие фокальные адгезии вместе с ассоциированными с ними пучками актиновых фибрилл [ Rottner, ea 1999 ]. Однако область за быстро продвигающейся ламеллиподией клеток B16 занята редкой сетью актиновых филаментов [ 45a , Rottner, ea 1999 ], которая непрерывно переходит в часть филаментов, входящих в состав ламеллиподии (неопубликованные наблюдения). Похоже, что эта редкая сеть является важной компонентой мигрирующей клетки и может обеспечивать структурную целостность при отсутствии макроскопических пучков.
В качестве третьего примера мы берем фибробласты клеточной линии золотых рыбок ( Рис. 4 ). В этих клетках мигрирующий фронт представлен главным образом филоподиями которые могут выпячиваться на 10-20 микрон от клеточного края. Сегменты ламеллиподии связывают соседние филоподии и филоподии и ламеллиподии вместе могут претерпевать активные сократительные и волнообразные движения между фазами протрузии. Заметным отличительным свойством этих клеток является образование выраженных структур адгезии главным образом ассоциированных с основаниями филоподий ( Рис. 4В ). Эти "фокальные комплексы" или преходящи, с временем жизни порядка 5-15 минут, или выживают и дифференцируются в фокальные адгезии. В живых клетках дискретные точки адгезии не лоцируются в ламеллиподиальных сегментах, где в электронный микроскоп видны два различных типа организации актиновых филаментов, залуживающих упоминания. (неопубликованные наблюдения, Рис. 4 ). В доном случае в ламеллиподии наблюдается характерная сетка (обсуждается в [ Small, ea 1988 ]) c уменьшением плотности филаментов от фронтального края к заднему с некоторыми филаментами протягивающимися от переднего края в редкую сетку сзади. Во втором случае ламеллиподии уже и ограничены у основания плотным пучком актиновых филаментов, которые объединены с фланговыми филоподиями. Эти две морфологии могут быть сопоставлены соответственно с фазами протрузии и ретракции, когда "сжатие филаментов" [ Hoglund, ea 1980 ] между филоподиями и ассоциированными с ними точками адгезии помогают удержать край клетки при ретракции ламеллиподии. В контексте обсуждения регулирующего влияния Rho GTPазы инжекция конститутивно активной Rac1 в фибробласт рыбы экспрессирущий GTP-VASP приводит к трансформации клеточного фронта от доминируемого филоподиями к доминируемому ламеллиподией и фокальными комплексами (Каверина, неопубликованные наблюдения), напоминающие наблюдавшиеся в B16 клетках меланомы. Эти наблюдения снова подчеркивают, что стратегии адгезии являются следствием тонкого баланса активности Rho GTPаз.
Наконец, заслуживает упоминания уникальный тип адгезивного контакта обнаруженный в клетках моноцитной линии, называемых подосомами [ Kanehisa, ea 1990 , Tourkin, ea 1996 , Suzuki, ea 1998 , Ory, ea, 2000 , Linder, ea, 2000 , Burns, ea, 2001 ]. Впервые наблюдавшиеся в некоторых вирусно трансформированных клетках [ Burridge, ea 1983 , Tarone, ea, 1985 ] подосомы характеризуются кольцевыми структурами составленными из активного ядра и адгезионных белков на периферии. В дифференцированных остеопластах подосомы образуются в виде выраженной структуры по периферии клеток которая по-видимому действует как уплотнение вокруг центральной зоны ресорбции [ Burridge, ea 1983 ]. Подосомы не перемещаются но это динамические образования, разбирающиеся (растворяющиеся) и вновь формирующиеся в новых местах со временем жизни 2-12 минут ( [ Kanehisa, ea 1990 ], F/Bard, частное сообщение). Данные по динамике подосом в движущихся клетках все еще не существуют. Но кажется что подосомы образуются под узкой ламеллиподией [ Linder, ea, 2000 , Burridge, ea 1983 ], F.Bard, частное сообщение) которая по-видимому активна при протрузии.
