ДНК: химическая схема синтеза
Как известно, элонгация цепи ДНК проходит в результате ее поэтапного удлинения за счет включения нуклеотидных остаков по 3'-концу дДНК. Субстратами (строительным материалом и источником энергии) для процесса элонгации служат dNTP ( Рис. 1 ). В нормальных условиях в сфере реакции присутствуют dNTP, это dATP, dCTP, dTTP и dGTP. Они поочередно связываются активным комплексом [ДНК-полимераза + М-дДНК] и в результате проб и ошибок отбирается dNTP, соответствующий правильному спариванию с матричным нуклеотидом по Уотсону-Крику. После этого фермент катализирует образование фосфоэфирной связи между 3'-гидроксилом дДНК и aльфа-фосфатом dNTP. Далее фермент транслоцирует на один шаг вдоль по одноцепочечному участку матрицы с диссоциацией пирофосфата (PPi), при этом выделяется 5-8 ккал, что сдвигает равновесие реакции в сторону полимеризации. Однако наряду с этим все ДНК-полимеразы в отсутствие dNTP и в присутствии PPi катализируют и обратную реакцию образования dNTP .
За счет этих двух реакций ДНК-полимеразы катализируют пирофосфатный и нуклеотидный обмен с соответствующими субстратами реакции. Так, в присутствии меченного 32P-PPi dNTP частично превращается в [бета,гамма-32P]dNTP ( Рис. 2 ), а нуклеотидный обмен происходит при остановке элонгации дДНК из-за отсутствия следующего комплементарного матрице dNTP, о чем можно судить при внесении в среду [aльфа-32P]dNTP, соответствующего последнему нуклеотидному остатку ( Рис. 3 ) [см. Kornberg ea 1982 , Краевский ea 1986 ].
Химический механизм образования новой фосфоэфирной связи в дДНК из ангидридной связи dNTP или в обратной реакции - переноса нуклеотидного остатка из фосфодиэфирной группы 3'- конца дДНК на PPi - в общих чертах достаточно изучен. В обычных условиях она проходит по механизму SN2 , что подтверждается обращением конфигурации заместителей относительно реагирующего фосфатного остатка ( Рис. 4 ). В соответствии с Рис. 4 ДНК-полимеразы катализируют нуклеофильную атаку 3'-гидроксила дДНК на aльфа-фосфат dNTP, причем стереохимически эта реакция проходит по механизму нуклеофильного замещения in-line* с образованием пентаковалентного переходного состояния. Задачей ДНК-полимераз в данной реакции является обеспечение образования специфичного по отношению к матрице комплекса [ДНК-полимераза + М-дДНК], последующее связывание dNTP, катализ одной или нескольких нехимических стадий (конформационных превращений) для образования продуктивного комплекса [ДНК-полимераза + М-дДНК + dNTP], катализ химической реакции, освобождение PPi и транслокация в новое положение вдоль по матрице. Механизм с обращением конфигурации около фосфора доказан с помощью хиральных aльфа-тио-dNTP, нуклеотидный остаток которых включается в ДНК при катализе различными ДНК-полимеразами, в результате чего образуется новая фосфотиоатдиэфирная группа с обращенной конфигурацией относительно атома фосфора (см. [ Краевский ea 1986 ]).
Данные рентгеноструктурного анализа нескольких ДНК-полимераз в комплексах [дДНК + dNTP] подтверждают это положение. На Рис. 5 показана схема активного комплекса обратной транскриптазы вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) для случайного набора нуклеотидных остатков дДНК и dNTP [ Kohlstaedt ea 1992 , Huang ea 1998 ]. Для ДНК-полимеразы I из E. coli [ Polesky ea 1990 , Polesky ea 1992 ] и ряда других [ Joyce ea 1994 , Pelletier ea 1994 , Eom ea 1996 ] схема активного центра принципиально не отличается; естественно нумерация остатков аспарагиновой кислоты для каждой ДНК-полимеразы своя.
Синтез ДНК происходит в ходе таких важнейших клеточных процессов, как репликация и репарация ДНК , обратная транскрипция, генетическая рекомбинация и перенос мобильных генетических элементов. Ферменты, осуществляющие ДНК-зависимый синтез ДНК, или ДНК-полимеразы, обнаружены во всех бактериальных, растительных и животных клетках.
Образование фосфоэфирной связи, катализируемое ДНК-полимеразами, происходит в результате нуклеофильной атаки 3'-концевого гидроксила праймера на атом фосфора альфа-фосфатной группы dNTP. Стереохимия этого процесса была детально изучена, и к настоящему времени известно, что реакция протекает по механизму SN2 [ Краевский ea 1986 ]. Исследования, проведенные с использованием альфа- тионофосфатных аналогов dATP, показали, что в ходе образования фосфоэфирной связи происходит инверсия конфигурации при альфа-атоме фосфора [ Burgers ea 1979 , Brody ea 1981 ].
Полученные данные также свидетельствуют, что связанные с ферментом 3'-концевой нуклеотидный остаток праймера и dNTP взаимодействуют непосредственно, т. е. без образования промежуточных соединений, ковалентно связанных с ферментом [ Brody ea 1981 ].
