Межнуклеозидные группы, образуемых ДНК-полимеразами
В ходе полимеризации dNTP в клетке ДНК-полимеразы катализируют образование фосфоэфирных связей ( рис. 1а ).
Имеющиеся литературные данные свидетельствуют, что ДНК-полимеразы могут катализировать образование модифицированных межнуклеозидных групп. Реакция может протекать только путем присоединения dNTP, модифицированных по альфа-фосфатной группе, к 3'-концу праймера; при этом 3'-концевой нуклеотидный остаток праймера непременно должен содержать 3'-гидроксил. Иными словами, полимеризация dNTP ДНК-полимеразами может происходить только через нуклеофильную атаку 3'-гидроксила на альфа-фосфорный атом; при этом допускается некоторое изменение электронной структуры атома фосфора.
В частности, показано, что ДНК-полимеразы катализируют образование фосфотионодиэфирных ( рис. 1б ) [ Burgers ea 1979 , Brody ea 1981 , Romaniuk ea 1982 , Gupta ea 1982 , Kunkel ea 1981 , Bartlett ea 1982 ], фосфоэфир-амидных ( рис. 1в ) [ Eetsinger ea 1976 , Chen ea 1976 ] и фосфотиодиэфирных ( рис. 1г ) [ Rybakov ea 1981 ] межнуклеозидных групп.
Было обнаружено, что 2'-дезокситимидин-5'- (альфа-метилфосфонил) -B, гамма-дифосфат ( рис. 1а ) и З'-фтор-2', З'- дидезокситимидин-5'- (а-метилфосфонил) -B,гамма-дифосфат ( рис. 1б ) включаются в цепь ДНК ДНК-полимеразой бета из печени крысы, фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I из Е. coli, а также обратными транскриптазами ВИЧ и ВМП и ТДТ из тимуса теленка [ Victorova ea 1992 , Дяткина ea 1941 ]. Однако эти соединения не утилизировались ДНК-полимеразами альфа и епсилон из плаценты человека. Позднее было показано, что некоторые ДНК-полимеразы утилизируют соединение II [ Dyatkina ea 1995 ]. Следовательно, некоторые ферменты, в том числе эукариотическая ДНК-полимераза бета , катализируют образование фосфоноэфирных межнуклеозидных групп ( рис. 1д ).
Модифицированные dNTP III терминировали синтез ДНК, катализируемый ДНК-полимеразами альфа из тимуса теленка, бета из печени крысы, I из Е. coli, а также обратными транскриптазами ВМП и ТДТ из тимуса теленка [ Chidgeavadze ea 1984 ], т.е. олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие нуклеотидный остаток на 3'- конце, не способны праймировать синтез ДНК.
Показано, что З'-меркапто-З'-дезокситимидин-5'-трифосфат является терминатором синтеза ДНК, катализируемого обратными транскриптазами ВИЧ и ВМП, но не утилизируется ДНК-полимеразой альфа из тимуса теленка, фрагментом Кленова ДНК-полимеразы I из Е. coli и ТДТ из тимуса теленка [ Южаков ea 1991 ].
Изучение субстратных свойств проводилось при рН 7-9, 5, т. е. 3'-аминогруппа находилась как в протонированной, так и в депротонированной формах [ Kutateladze ea 1983 , Зайцева ea 1984 ].
