Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (ТДТ): праймеры
Зависимость эффективности полимеризации dNTP, катализируемой ТДТ, от длины праймера была исследована вскоре после первого выделения фермента [ Kato ea 1967 ]. Данные этих исследований приведены в табл. Очевидно, что минимальным праймером для ТДТ является тринуклеотид, содержащий свободный 3'-гидроксил и 5'-концевой фосфат. Kato и соавт. также изучили зависимость сродства праймера к ТДТ от его нуклеотидного состава. Было показано, что сродство олигонуклеотидов убывает в следующем ряду:
d (pl) > d (pG) > d (pA) > d (pT) > d (pC) [ Kato ea 1967 ].
Эффективность полимеризации dATP в присутствии различных олигонуклеотидов [ Kato ea 1967 ]
Праймер................... Уменьшение концентрации dATP в смеси, %
- .................. < 2
d (ApA) ................ < 2
d (ApApA).................< 2
d (pApApA)................32
d (ApApApA)..............27
d (TpTpT)................2
d (pTpTpT)................24
d (TpTpTpT)...............21
Олигонуклеотиды с замещенным 5'-фосфатом также способны инициировать синтез полинуклеотидов, катализируемый ТДТ [ Ott ea 1967 ]. Олигорибонуклеотиды не могут служить праймерами для ТДТ, но олигорибонуклеотиды, содержащие 1-2 дезоксирибонуклеотидных остатка на 3'-конце, эффективно праймируют реакцию, катализируемую этим ферментом [ Feix ea 1967 ].
ТДТ способна присоединять нуклеотиды к обоим 3'-гидроксильным группам олигонуклеотида типа 3'-(pdN)n(pdN)m-3' [ Schwartz A. W., F. N. Hayes, 1967 ].
Deng и Wu [ Deng ea 1981 ] оценили способность различных двухцепочечных ДНК инициировать синтез полинуклеотидов ТДТ. Было показано, что лишь ДНК с выступающими 3'-концами является эффективным инициатором синтеза, тогда как ДНК с тупыми концами и дуплексы с выступающими 5'-концами праймируют реакцию менее эффективно. Интересно, что праймирующая способность дуплексов с тупыми концами зависела от природы нуклеотидных пар на концах. Из табл 3 . видно, что дуплексы с концами, богатыми dA-dT парами, инициировали полимеризацию гораздо эффективнее, чем ДНК с концами, богатыми dG-dC парами.
Таблица. Эффективность удлинения тупых концов дуплексов ДНК терминальной дезоксинуклеотидилтрансферазой в присутствии различных dNTP [ Deng ea 1981 ] dNTP Фракция ДНК с удлиненными концами, % Концы, богатые парами dG: dC Концы, богатые парами dA: dT dATP 17 81 dGTP 95 95 dCTP 20 80 dTTP 27 72
Авторы делают вывод, что дуплексы ДНК с тупыми концами, а также дуплексы с 5'-выступающими концами способны инициировать полимеризацию, катализируемую ТДТ, благодаря временному разрыву водородных связей между нуклеиновыми основаниями концевых нуклеотидов. В присутствии низких концентраций какодилат-анионов ТДТ способна синтезировать полинуклеотидную цепь в отсутствие праймера, однако этот процесс начинается только по прошествии значительного времени [ Kato ea 1967 ].
