Терминальная дезоксинуклеотидилтрансфераза (ТДТ): субстратная специфичность
Все четыре природных dNTP являются субстратами ТДТ, хотя кинетические параметры их включения в полинуклеотидную цепь различаются [ Kato ea 1967 ].
Оказалось, что TDT отличается от остальных ДНК-полимераз в отношении субстратной специфичности тем, что она может включать в олигонуклеотиды нуклеотидные остатки из a-dNTP, L-dNTP [ Semizarov ea 1994 , Dyatkina ea 1996 , Dyatkina ea 1995 , Krayevsky ea 1999 ] и даже фосфаты или замещенные фосфаты.
Сродство перечисленных соединений к ТDT не сильно отличается от такового для dNTP. Это позволяет сделать заключение, что dNTP специфично связывается с активным центром фермента исключительно трифосфатным остатком dNTP, что определяет механизм отбора субстратов этим ферментом.
Данные, полученные Basu и соавт. [ Basu ea 1983 ], свидетельствуют, что полидезоксирибонуклеотиды, синтезированные ТДТ в присутствии эквимолярной смеси четырех dNTP, весьма богаты остатками дезоксигуаниловой кислоты.
Авторы высказали предположение, что в присутствии всех четырех dNTP фермент имеет повышенное сродство к dGTP [ Sarin ea 1974 ]. Modak [ Modak ea 1979 ] обнаружил, что в присутствии Мп2+ dATP ингибирует синтез ДНК, катализируемый ТДТ, и исследовал механизм ингибирования.
Было показано, что увеличение концентрации праймера уменьшает ингибирующий эффект dATP и что добавление избытка праймера в реакционную смесь позволяет вновь инициировать остановленную реакцию. Автор сделал вывод, что молекулы праймер а участвуют в ингибировании. Кинетические эксперименты выявили конкурентный характер ингибирования: характер графиков Хилла указывает на то, что Mn2+ -dATP и Mn2+ -dGTP связываются с одним и тем же сайтом фермента. Кроме того, было обнаружено, что в присутствии Мп2+ dATP полимеризуется в 50 раз медленнее, чем другие dNTP. Таким образом, ингибирующий эффект dATP на полимеризацию нуклеотидов, катализируемую ТДТ в присутствии Мп2+ объясняется тем, что dATP связывается с активным центром ТДТ с высоким сродством, превышающим сродство других dNTP, но включается в полинуклеотидную цепь гораздо медленнее, чем другие dNTP [ Modak ea 1979 ]. ТДТ способна утилизировать рибонуклеотиды в качестве субстратов [ Modak ea 1979 , Feix ea 1967 , Beabealashvilli ea 1986 , Modak ea 1978 , Pandey ea 1989 , Pandey ea 1988 , Bhalla ea 1977 , Koessel ea 1971 , Roychoudhury ea 1971 , Roychoudhury ea 1971 , Feix ea 1971 , Roychoudhury ea 1972 , Abraham ea 1983 ].
В 1978 году Modak сообщил, что АТР связывается с ферментом, но не удлиняет (dA)#12-18 тогда как GTP, СТР, и в меньшей cтетепени UTP, элонгируют праймер как в отсутствие, так и в присутствии dNTP [ Modak ea 1979 ].
Данные, полученные в упомянутой работе, свидетельствуют о том, что АТР эффективно ингибирует полимеризацию dNTP, GTP и СТР по конкурентному механизму. В то же время, по данным Бибилашвили и соавт. [ Beabealashvilli ea 1986 ], ТДТ способна включать в цепь ДНК по 2 остатка rСМР, rАМР или rUMP. При этом скорость включения изученных rNMP составляет 0,1-0,2 от скорости включения dNTP. Очевидно, число включенных остатков rNMP ограничивается двумя потому, что олигодезоксирибонуклеотиды, содержащие на 3'-конце 2 остатка rNMP, не способны праймировать синтез ДНК, катализируемый ТДТ, возможно, из-за отличий в конформации от oligo (dN).
В связи с независимостью ТДТ от матрицы возникает вопрос: участвует ли нуклеиновое основание в связывании dNTP с ферментом? В этой связи особый интерес представляют данные по субстратным свойствам dNTP, модифицированных по нуклеиновому основанию. Известно, что dNTP с замещенными аминогруппами оснований являются субстратами ТДТ, но скорость их полимеризации значительно меньше, чем скорость полимеризации природных dNTP, а образующиеся полимеры существенно короче полимеров, синтезированных ферментом в присутствии природных dNTP [ Ratliff ea 1981 ]. Исключением является полимерный продукт, состоящий из остатков N-ацетилдезоксигуаниловой кислоты: его длина в среднем превышает длину poly (dG), синтезированного ТДТ [ Hansbury ea 1970 , Fluegel ea 1973 , Lefler ea 1969 , Hayes ea 1968 ].
Вероятнее всего, этот эффект объясняется тем, что poly (dG) склонен к аггрегации в растворе и потому является не очень эффективным праймером для ТДТ, тогда как poly (N-aцетил-dG) не аггрегирует.
Было также показано, что ТДТ способна полимеризовать 5-метил-dCTP ( XXVI ) [ Zmudzka ea 1969 ] и 6-О-метил-dGTP ( XXVII ) [ Abbott ea 1980 ].
8-Азидо-АТР ( XXVIII ) эффективно связывается с активным центром фермента, конкурируя с dNTP. Это соединение было использовано для фотоафинного мечения ТДТ [ Abraham ea 1983 ]. Было показано, что фермент способен утилизировать флуоресцентный аналог уклеотида 1,N6#-этенодезоксиаденозин 5'-трифосфат ( XXIX ) в присутствии олигодезоксинуклеотидного праймера [ Deibel ea 1985 ]. Авторы утверждают, что введение этено-замещенных нуклеотидных остатков в полинуклеотидную цепь не ухудшает ее праймирующих свойств. Поскольку количество этено-dAMP, включенного в ДНК, может быть определено измерением флуоресценции полимера, система, описанная в цитируемой работе, может использоваться для определения активности ТДТ.
Авторы предложили использовать ее для определения уровня фермента у больных лейкемиями [ Deibel ea 1985 ].
Приведенные данные свидетельствуют, что хотя ТДТ способна полимеризовать нуклеотиды, модифицированные по нуклеиновому основанию, в большинстве случаев скорость их полимеризации ниже, а длина образующихся продуктов меньше, чем в случае природных dNTP. Можно заключить, что модификация нуклеинового основания препятствует специфическому связыванию dNTP с активным центром ТДТ. Арабинонуклеозид-5'-трифосфаты утилизируются ТДТ [ Dicioccio ea 1977 ].
3-Дезоксиаденозин 5-трифосфат ( XXX ) [ Ratliff ea 1981 ] включается в цепь ДНК при катализе ТДТ и терминирует ее элонгацию.
В литературе накоплено много данных по субстратным свойствам 3'-замещенных dNTP по отношению к ТДТ. В частности известно, что фермент утилизирует 2',3'-дидезокситимидин-5'-трифосфат ( VIIIr ) [ Beabealashvilli ea 1986 ], 3'-амино-2'З'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфаты [ Chidgeavadze ea 1984 , Chidgeavadze ea 1986 , Beabealashvilli ea 1986 , Зайцева ea 1984 , Краевский ea 1987 ], 3'-фтор-2', 3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфаты ( Х ) [ Dyatkina ea 1987 ], 3'-хлор-2', 3'-дидезоксинуклеозид-5'-трифосфаты ( XXXI ) [ Чиджавадзе ea 1989 ] и 3'-амино-3'-дезоксиарабинонуклеозид-5'-трифосфаты [ Chidgeavadze ea 1984 , Chidgeavadze ea 1986 ].
В отдельную группу следует выделить модифицированные dNTP с уплощенной структурой гликона. Показано, что ТДТ включает в 3'-конец цепи ДНК 2', 3'-дeзoкcи-2', 3'-дeгидpoнyклeoзид-5'-тpифocфaты ( XII ) [ Dyatkina ea 1987 ] и их ациклические аналоги ( VI ) [ Krayevsky ea 1993 , Викторова ea 1993 ].
Введение некоторых заместителей в трифосфатный фрагмент dNTP также не лишает соединение субстратных свойств по отношению к ТДТ. Было обнаружено, что производные dNTP, содержащие метильный ( I ) [ Victorova ea 1992 , Дяткина ea 1941 ] и фенильные ( II ) [ Dyatkina ea 1995 ] заместители при альфа-атоме фосфора, а также соединение XXXII [ Розовская ea 1993 ] включаются ферментом в цепь ДНК. Следовательно, ТДТ способна катализировать образование неионных фосфоноэфирных связей.
Приведенные данные свидетельствуют, что ТДТ в целом менее специфична к нуклеотидным субстратам, чем репликативные ДНК-полимеразы эукариот.
Адениновые 5'-5'-динуклеотиды Ар2А, АрзА, Ар4А, Ар5А и Ар6А ( ХХХIII ) ингибируют синтез ДНК, катализируемый ТДТ [ Ono ea 1980 , 157 , 158 ]. Все исследованные соединения оказались эффективными ингибиторами синтеза ДНК, катализируемого ТДТ; Ар5А и АР6А ингибировали синтез сильнее, чем динуклеотиды, содержащие меньшее число фосфатных групп, и конкурировали с dNTP и праймером [ Pandey ea 1987a ]. Эти два динуклеотида также блокировали УФ-индуцированное ковалентное присоединение нуклеотидных субстратов и праймера к ферменту. На основании приведенных данных Pandey и Modak [ Pandey ea 1987 ] заключили, что Ар5А и Ар6А ингибируют катализируемый ТДТ синтез полинуклеотидов, связываясь одновременно с dNTP-связывающим и праймер-связывающим сайтами активного центра. Действительно, константа диссоциации комплекса Ар5А-фермент, в котором лишь один из упомянутых сайтов участвует в связывании, оказалась приблизительно в шесть раз больше константы диссоциации комплекса, в котором оба сайта доступны молекулам Ар5А [ Pandey ea 1987 ].
