РНК-интерференция: гены, необходимые для осуществления процесса
Значительный прогресс в изучении РНК-интерференции и PTGS у растений был достигнут благодаря скринингу генов, необходимых для этих процессов ( Ketting et al., 1999 ; Tabara et al., 1999 ). Поскольку для скрининга нужно исследование большого количества особей, введение двухцепочечной РНК осуществлялось не путем инъекций, а с использованием бактерий, которые благодаря наличию специального вектора производили двухцепочечную РНК к жизненно-важному гену C. elegans ( Tabara et al., 1999 ). Добавление таких бактерий в корм приводило к стерильности особей дикого типа вследствие нарушения функции pos-1-гена , экспрессирующегося в герминальных клетках и необходимого для развития эмбрионов. После мутагенеза были отобраны потомки особей, оказавшихся фертильными в результате нарушения в системе РНК-интерференции.
Необходимо отметить, что при такой системе поиска мутаций невозможно выявить жизненно важные гены, мутации по которым летальны. Кроме того, скрининг не позволяет идентифицировать гены с дублированными функциями, т.к. в этом случае мутация по одному гену компенсируется нормальной работой другого. Несущие мутации в названных rde-генах (RNAi deficient) особи C. elegans практически нечувствительны к инъекциям двухцепочечной РНК. Для нескольких rde-генов были установлены соответствующие открытые рамки считывания путем восстановления чувствительности к двухцепочечной РНК после инъекции плазмид, содержащих соответствующие гены. Всего в результате скрининга было найдено четыре rde-гена.
Мутации в rde-генах не вызывали каких-либо существенных фенотипических проявлений, кроме резистентности к РНК-интерференции, однако мутации в генах rde-2 и rde-3 приводили также к активации транспозиций мобильных элементов нескольких различных семейств ( Tabara et al., 1999 ). У мутантов по генам rde-1 и rde-4 таких свойств обнаружено не было.
Активация транспозиций при мутациях в нескольких rde-генах заставила исследователей проанализировать чувствительность к двухцепочечной РНК при мутациях в генах, выявленных при скрининге на повышенную частоту транспозиций мобильных элементов (так называемых mut-генов ) ( Ketting et al., 1999 ). В результате было показано, что мутации в некоторых mut-генах ( mut-2 , mut-7 и mut-14 ) приводят не только к увеличению частоты транспозиций мобильных элементов, но и к устойчивости к инъекциям двухцепочечной РНК ( Ketting et al., 1999 ; Tijsterman et al., 2002 ). У других mut-генов такие свойства не найдены.
Таким образом в сумме было идентифицировано 7 генов, участвующих в РНК-интерференции у C. elegans, 5 из которых отвечают и за контроль перемещений транспозонов. Эти исследования впервые показали, что возможной физиологической ролью РНК-интерференции у С. elegans является подавление активности мобильных элементов.
Мутации по генам rde и mut рецессивны за исключением гена mut-2, мутация по которому доминантна ( Tabara et al. 1999 ).
Использованная методика скрининга была направлена в первую очередь на выявление генов, необходимых для РНК-интерференции в герминальных тканях. Соответственно все 7 найденных генов (rde1-4, mut-2, mut-7 и mut-14) строго необходимы для осуществления РНК-интерференции в герминальных тканях ( Ketting et al., 1999 ; Tabara et al., 1999 ; Tijsterman et al., 2002 ).
Однако у животных, мутантных по генам rde-2 и mut-7, в отличие от мутаций по другим генам групп mut и rde, РНК-интерференция в соматических тканях подавляется не полностью, хотя ее эффективность оказывается значительно сниженной ( Tabara et al. 1999 ). Можно предполагать, что продукты двух этих генов необходимы в первую очередь для РНК-интерференции в клетках зародышего пути, а в соматических тканях их функции продублированы продуктами других генов, не идентифицированных к настоящему моменту.
