РНК-интерференция: роль генов rde и mut у C. elegans
Гены rde и mut могут быть разбиты на 2 класса:
- мутации в генах rde-1 и rde-4 приводят к нарушению РНК-интерференции, но не активируют транспозиции мобильных элементов, в то время как
- мутации в генах mut-2 , mut-7 , rde-2 и rde-3 вызывают активацию транспозиций мобильных элементов . Кроме неспособности к РНК-интерференции и индукции мобильных элементов при мутациях по генам mut-2, mut-7, rde-2 и rde-3 обнаруживаются частые потери X-хромосомы при мейозе (увеличенный процент самцов в потомстве) и пониженная фертильность ( Tabara et al. 1999 ).
Благодаря эффекту наследования РНК-интерференции был проведен генетический анализ стадии действия различных rde- и mut-генов ( Grishok et al., 2000 ). Животным, гетерозиготным (т.е. обладающим нормальной функцией) по различным rde- и mut-генам, инъецировалась двухцепочечная РНК к экспрессирующемуся в герминальных клетках гену pos-1 , после чего эффект РНК-интерференции анализировался в потомках (F1) этих животных, часть из которых была гомо-, а часть - гетерозиготна по соответствующему rde-гену:
P (инъецированные): rde +/-
F1: rde +/-; rde -/-
При этом оказалось, что потомки, гомозиготные по мутациям в генах rde-1 и rde-4, проявляют нормальный эффект РНК-интерференции, в противоположность гомозиготам по мутациям в генах rde-2 и mut-7.
Таким образом, гены rde-1 и rde-4 нужны только для инициации РНК-интерференции у инъецированных животных и не являются необходимыми для ее проявления в следующем поколении ( Grishok et al. 2000 ). При этом для инициации необходимо одновременное присутствие в организме белковых продуктов гена rde-1 и гена rde-4 ( Grishok et al. 2000 ).
Можно предположить, что белковые продукты генов rde-1 и rde-4 играют роль в узнавании, поддержании стабильности двухцепочечной РНК или же транспортировке двухцепочечной РНК от места инъекции к другим тканям организма.
Для проверки этого предположения гомозиготных по мутациям животных подвергали иньекциям двухцепочечной РНК к гену unc-22 , экспрессирующемуся в соматических тканях ( Tabara et al. 1999 ). Потомство иньецированных мутантных животных (F1) содержало данные мутации в гетерозиготе или гомозиготе:
P (инъецированные): rde -/-
F1: rde +/-; rde -/-
В результате у гетерозиготного потомства подавлялась экспрессия гена, гомологичного двухцепочечной РНК, введенной родителям, несмотря на то, что родители были мутантными по генам rde-1 или rde-4 ( Tabara et al. 1999 ). Эти результаты показывают, что хотя гены rde-1 и rde-4 нужны на стадии инициации РНК-интерференции, передача сигнала от родителя к потомку не требует присутствия этих генов у родителя и, следовательно, соответствующие белковые продукты не играют никакой роли в передаче сигнала, полученного при введении животным двухцепочечной РНК.
Дальнейший генетический анализ был проведен для того, чтобы выяснить, могут ли гены первой группы, необходимые для инициации РНК-интерференции (rde-1 и rde-4), действовать независимо от генов второй группы (rde-2 и mut-7). Скрещивания проводились таким образом, что инъецированные животные были гетерозиготны по гену первой группы (rde-1) и гомозиготны по гену второй группы (rde-2 или mut-7), а их потомки (F1) - наоборот:
P(инъецированные): rde-2 -/-; rde-1 +/-
F1: rde-2 +/-; rde-1 -/-
Оказалось, что потомки проявляют эффект РНК-интерференции, т.е. гены rde-2 и mut-7 способны действовать отдельно от генов rde-1 и rde-4 и, в противоположность им, не играют никакой роли в инициации РНК-интерференции, но оказываются важными на последующей стадии для ее непосредственного осуществления ( Grishok et al. 2000 ).
Полученные генетические данные свидетельствуют о существовании двух функционально различающихся групп белков, осуществляющих РНК-интерференцию. Белки первой группы - продукты генов rde-1 и rde-4 - необходимы для генерации сигнала, образующегося в результате попадания в клетку двухцепочечной РНК, и эти белки выступают в роли инициаторов РНК-интерференции ( табл. 1 ). Белки второй группы, кодируемые генами rde-2 и mut-7, выступают в роли эффекторов, непосредственно осуществляя подавление экспрессии гена, гомологичного двухцепочечной РНК.
Несмотря на необходимость присутствия продуктов генов rde-2 и mut-7 для осуществления РНК-интерференции в вышеописанных экспериментах, следует отметить, что это присутствие абсолютно необходимо только для подавления генов, экспрессирующихся в герминальных тканях.
Деление генов rde и mut на 2 группы согласно стадии действия соответствующих белковых продуктов коррелирует с эффектом влияния этих генов на активацию транспозиций мобильных элементов и частоту потери X-хромосомы в мейозе. Белки первой группы, по-видимому, участвуют только в РНК-интерференции, но не в контроле транспозиций мобильных элементов, в то время как белки второй группы принимают участие в обоих процессах.
Несколько исследований было посвящено изучению участия генов, необходимых для РНК-интерференции в процессе косупрессии в герминальной ткани C. elegans ( Dernburg et al., 2000 ; Tabara et al., 1999 ). Инъекция ДНК в C. elegans приводит к образованию внехромосомных стабильно наследуемых молекул ДНК, содержащих многочисленные копии трансгена.
В случае трансгена, экспрессирующегося в соматических тканях, инъекция обычно приводит к восстановлению функции на фоне нарушенного соответствующего эндогена. Однако в случае герминально-экспрессирующегося гена обычно наблюдается противоположный эффект - присутствие внехромосомных молекул трансгена приводит к подавлению экспрессии нормально экспрессировавшегося до этого эндогена.
Анализ исследований о влиянии мутаций в различных rde- и mut-генах показал, что только мутации во второй группе генов (rde-2 и mut-7, а также mut-14 ) нарушают также косупрессию в герминальной ткани C. elegans ( Dernburg et al., 2000 ; Tabara et al., 1999 ; Tijsterman et al., 2002 ). Мутации в генах первой группы (rde-1), участвующих только в РНК- интерференции, и мутации в mut-генах, приводящие к активации транспозиций мобильных элементов, но не влияющие на РНК-интерференцию, не оказывают влияние на косупрессию.
