РНК-интерференция: образование siRNA (gRNA)
Первым шагом на пути к установлению биохимического механизма РНК-интерференции была демонстрация того, что искусственно синтезированная мРНК подвергается специфической ATP-зависимой деградации в эмбриональном экстракте при добавлении в систему гомологичной двухцепочечной РНК ( Tuschl et al. 1999 ; Zamore et al. 2000 ). Однако, в противоположность инъекциям in vivo, реакция in vitro требует избытка двухцепочечной РНК относительно мРНК, что может свидетельствовать о нарушенном in vitro механизме усиления сигнала РНК-интерференции.
Преинкубация двухцепочечной РНК с экстрактом перед добавлением мРНК значительно усиливает эффект РНК-интерференции, что говорит о том, что двухцепочечная РНК должна сначала каким-то способом активироваться для индукции деградации мРНК ( Tuschl et al., 1999 ).
В согласии с результатами, полученными in vivo, увеличение длины двухцепочечной РНК приводило к более сильному эффекту деградации in vitro ( Tuschl et al., 1999 ). Дальнейшие эксперименты на бесклеточной системе показали, что внесенная в экстракт двухцепочечная РНК подвергается процессингу с образованием коротких РНК длиной в 21-23 нуклеотида ( Zamore et al. 2000 ), при этом гомологичная мРНК также расщепляется на короткие фрагменты аналогичной длины (21-23 нуклеотида) ( Hammond et al. 2000 ; Zamore et al. 2000 ).
Короткие молекулы РНК размером порядка 25 нуклеотидов впервые обнаружили А.J. Hamilton и D.C.Baulcombe ( Hamilton and Baulcombe, 1999 ) при изучении косупрессии (PTGS) у растений. В этой работе было определено, что в трех различных случаях PTGS, индуцированного трансгенами, а также в случае PTGS, вызванного вирусом, в клетках растений обнаруживаются короткие смысловые и антисмысловые РНК, соответствующие по последовательности матричной РНК-мишени, при этом количество коротких РНК коррелирует с силой косупрессии.
Впоследствии образование коротких (21-25 нуклеотидов) РНК было показано при введении двухцепочечной РНК в организм C. elegans ( Parrish et al. 2000 ) и в эмбрионы дрозофилы in vivo ( Yang et al. 2000 ). Это привело к предположению, что именно короткие (21-23 нуклеотида) РНК, образующиеся из длинных двухцепочечных РНК-дуплексов, являются активной формой сигнала для деградации мРНК при РНК-интерференции у животных и PTGS у растений.
Для обозначения таких молекул был предложен термин small interfering RNA ( siRNA ) или guide RNA ( gRNA ).
Общая модель механизма РНК-интерференции предполагает существование двух основных стадий: на первой стадии происходит процессинг двухцепочечной РНК на короткие 21-23 нуклеотидные РНК, на второй стадии siRNA в комплексе с белками узнают и направляют деградацию гомологичной мРНК.
