siRNA: Индукция РНК-интерференции
Для siRNA , полученных при процессинге двухцепочечной РНК, характерно присутствие 5`-концевого фосфата, 3`-концевой гидроксильный группы, а также выступающих 3'-концов в 2 нуклеотида, и содержат они в своем составе немодифицированные рибонуклеотиды помимо относительно небольшого количества дезаминированных остатков аденозина, образующихся, по-видимому, за счет активности двухцепочечной РНК-зависимой дезаминазы еще на стадии протяженного двухцепочечного РНК-дуплекса ( Elbashir et al., 2001b ; Zamore et al., 2000 ).
Благодаря специально разработанной схеме удалось клонировать siRNA, полученные при процессинге двухцепочечной РНК в бесклеточной системе из эмбрионов дрозофилы; оказалось, что около половины из них равны 21 нуклеотиду ( Elbashir et al., 2001b ).
Окончательное доказательство того, что siRNA являются не побочным продуктом, а посредником, направляющим деградацию мРНК, было получено, когда процесс деградации мРНК инициировали добавлением в бесклеточную систему искусственно синтезированные РНК (21-22 нуклеотида) в двуцепочечной форме ( Elbashir et al., 2001b ). При этом эффективное действие оказывали только дуплексы с выступающими концами в 2 нуклеотида, аналогичные тем, которые образуются при процессинге двухцепочечной РНК in vitro.
Выделенные из экстракта после процессинга двухцепочечной РНК siRNA также способны вызывать РНК-интерференцию при их добавлении к свежему экстракту, но только если в процессе выделения обе цепи siRNA не денатурированы ( Nykanen et al., 2001 ).
Функциональная анатомия siRNA была подробно изучена в работе Elbashir с соавт. ( Elbashir et al., 2001c ). Измеряя активности различных искусственно синтезированных siRNA при их добавлении к эмбриональному экстракту дрозофилы, авторы показали следующее:
- активные дуплексы должны иметь выступающие 3'-концы в 2 нуклеотида;
- при наличии таких выступающих 3'-концов наиболее активными оказываются siRNA размером в 21 нуклеотид; siRNA размером в 24 и 25 нуклеотида не вызывают детектируемого эффекта РНК-интерференции;
- 3'-выступающие концы siRNA могут содержать дезоксинуклеотиды без заметного влияния на эффективность РНК-интерференции; в целом, одна цепь siRNA может содержать до 8 дезоксинуклеотидных остатков, в то же время полная замена одной из цепей на ДНК приводит к неактивному дуплексу siRNA;
- последний 3'-нуклеотидный остаток siRNA не играет роли в узнавании РНК-мишени, в то время как предпоследний уже участвует в распознавании.
Значительные (3-4 нуклеотида) несоответствия последовательности siRNA и РНК-мишени приводят к нарушению РНК-интерференции, при этом наибольшее влияние оказывают замены, располагающиеся между серединой и 3'-концом siRNA.
Замена всего одного нуклеотидного остатка напротив сайта расщепления РНК-мишени приводит к полностью неактивной siRNA.
Искусственно синтезированные дуплексы siRNA с выступающими 3'-концами (размером в 2 нуклеотида) оказались эффективными в индукции РНК-интерференции у C. elegans при инъекциях in vivo ( Caplen et al., 2001 ) и в культуре клеток млекопитающих ( Caplen et al., 2001 ; Elbashir et al., 2001a ). В последнем случае siRNA не вызывают неспецифичного интерференового ответа, индуцируемого более протяженными молекулами двухцепочечной РНК в клетках млекопитающих, а как и при РНК-интерференции у беспозвоночных, приводят к специфичной деградации гомологичных мРНК. Наиболее активными при индукции РНК-интерференции в C. elegans оказываются искусственно синтезированные siRNA размером в 24-25 нуклеотидов, неэффективные в экстрактах дрозофилы ( Caplen et al., 2001 ).
В то же время в клетках млекопитающих наиболее эффективными оказались siRNA размером в 22-23 нуклеотида ( Caplen et al., 2001 ; Elbashir et al., 2001a ).
