RISC: модели механизма активации
RISC , осуществляющий вторую биохимическую стадию РНК-интерференции - деградацию мРНК , - является, по-видимому, мультибелковым комплексом, содержащим siRNA . Hammond с соавторами оценили массу всего комплекса RISC, выделенного из эмбрионального экстракта дрозофилы, приблизительно в 500 кДа, в то время как размер единственного известного компонента - белка AGO-2 - составляет только 130 кДа ( Hammond et al., 2001 ).
В состав RISC очевидно должен входить белок с эндонуклеазной активностью, которой, по-видимому, не обладают белки семейства Argonaute . В работе Elbashir с соавторами было высказано предположение о том, что один и тот же белок может проявлять эндорибонуклеазную активность, процессирующую и двухцепочечную РНК на siRNA, и последующую деградацию мРНК, что согласуется с наличием тесной связи между направлением процессинга двухцепочечной РНК и последующей специфичностью siRNA к атаке смысловых или антисмысловых мРНК ( Elbashir et al., 2001b ).
Однако по всей видимости это не так - в комплекс RISC не входит белок DICER , осуществляющий процессинг двухцепочечной РНК ( Hammond et al., 2001 ).
Одним из возможных кандидатов на нуклеазную активность в комплексе RISC является продукт гена mut-7 , участвующий во второй стадии РНК-интерференции. Ген mut-7 кодирует белок, имеющий протяженную область идентичности с каталитическим доменом 3'-5' экзорибонуклеазы E. coli (РНКазы D) , а также область, схожую с белком синдрома Вернера человека (Werner disease protein) ( Ketting et al. 1999 ), который обладает как РНК-азной, так и ДНК-азной активностями. Однако белок mut-7 не содержит домен ДНК-хеликазы , имеющейся в белке синдрома Вернера ( Ketting et al. 1999 ; Tabara et al. 1999 ).
В то же время ген mut-7 абсолютно необходим для РНК-интерференции только в герминальной ткани.
Таким образом, если MUT-7 и представляет собой нуклеазу комплекса RISC, то только в клетках зародышевого пути, и другие белки выполняют его функцию в соматических тканях.
Помимо эндорибонуклеазной активности RISC вероятно должен содержать РНК-хеликазную активность, необходимую для расплетания дуплекса siRNA и последующего гомологичного узнавания мРНК. Вероятно, именно этот компонент теряется при преобразовании неактивного (приблизительно в 360 кДа) комплекса RISC, содержащего неденатурированные siRNA, в активный (менее 232 кДа) комплекс RISC* , в котором siRNA находятся в одноцепочечном состоянии.
Потенциальные РНК-хеликазы были идентифицированы при скрининге генов, участвующих в пост-транскрипционном подавлении экспрессии ( PTGS ) у разных организмов: mut-6 у Chlamydomonas reinhardtii ( Wu-Scharf et al., 2000 ), SDE-3 у Arabidopsis ( Dalmay et al., 2001 ).
Ген smg-2 , необходимый для NMD и длительного поддержания эффекта РНК-интерференции, также является РНК-хеликазой. Однако маловероятно его функционирование в качестве РНК-хеликазы комплекса RISC, которая должна быть абсолютно обязательна для РНК-интерференции.
Более вероятным представляется функционирование в качестве РНКазы комплекса RISC продукта гена mut-14 , кодирующего DEAD-бокс РНК-хеликазу, необходимую для РНК-интерференции, репрессии транспозонов, косупрессии повторяющихся трансгенов, а также репрессии, вызванной короткими антисмысловыми олигонуклеотидами в герминальной ткани C. elegans ( Tijsterman et al., 2002 ).
Поскольку выбор активной цепи siRNA происходит на стадии процессинга двухцепочечной РНК, то это предполагает тесную связь стадий процессинга двухцепочечной РНК и деградации мРНК и, следовательно, ассоциацию соответствующих белковых комплексов.
Однако комплекс RISC, способный осуществлять деградацию мРНК в культуре клеток, находится во фракции, полученной ультрацентрифугированием при 100 тыс. g ( Hammond et al. 2000 ), при этом активность, необходимая для процессинга двухцепочечной РНК ( Dicer ), остается в супернатанте ( Bernstein et al. 2001 ).
Таким образом, Dicer и RISC, по-видимому, не образуют единого комплекса, что предполагает стадию передачи siRNA (с сохранением неравнозначности цепей, зависящей от направления процессинга двухцепочечной РНК) от DICER к RISC. Возможно, что передача siRNA от DICER к RISC осуществляется посредством взаимодействия PAZ-доменов , присутствующих в белках DICER и AGO-2 ( Baulcombe, 2001 ).
В соответствии с этим предположением, AGO-2 может быть осажден из экстракта культуры клеток антителами к DICER.
Однако данные о том, что искусственно синтезированные или очищенные от белков после процессинга siRNA способны эффективно вызывать деградацию мРНК, свидетельствуют о том, что непосредственный контакт между DICER и RISC не является необходимым для эффективного включения siRNA в RISC.
Можно предположить альтернативное объяснение роли белка AGO-2, учитывающее гомологию AGO-2 с RDE-1 , который, что ясно из совокупности биохимических и генетических данных, участвует в первой стадии РНК-интерференции , но не является необходимым для процессинга двухцепочечной РНК на siRNA.
Возможно, что AGO-2 (и RDE-1 у C. elegans) взаимодействует с DICER еще на стадии расщепления двухцепочечной РНК и, не являясь необходимым звеном для самого процессинга, в зависимости от его направления маркирует одну из цепей siRNA. Далее он остается связанным с siRNA, и комплекс AGO2-siRNA включается в состав RISC, привнося информацию о направлении процессинга двухцепочечной РНК.
Абсолютная необходимость активности RDE-1 для РНК-интерференции, в том числе и при использовании искусственных siRNA, говорит о том, что он выполняет и другие функции, помимо маркировки активной цепи в siRNA.
Генетические данные, свидетельствующие, что для РНК-интерференции активность генов I группы может быть достаточна в первом поколении, в то время как активность генов второй группы - у их потомков, указывают на то, что взаимодействие соответствующих белков необязательно.
Это означает, что предполагаемое присутствие RDE-1 в комплексе RISC не является необходимым для его активности. Возможно, что в этом случае, как и в случае использования искусственных siRNA, информация о направлении процессинга и выборе активной цепи siRNA теряется, что может быть проверено экспериментально.
Следует отметить, что подавление экспрессии ago-2 в культуре клеток дрозофилы приводит к нарушению РНК-интерференции, однако необходимость присутствия этого белка именно в комплексе RISC не была прямо показана. Этот вопрос требует проведения биохимических опытов по сборке комплекса RISC из очищенных компонентова.
