PTGS и TGS: метилирование последовательностей в ядре
Наиболее очевидный эффект PTGS , приводящий к изменению на уровне ДНК - это метилирование гомологичных последовательностей в ядре, обнаруживаемое практически во всех случаях PTGS у растений ( Dalmay et al., 2000a ; Jones et al., 1998 ; Jones et al., 1999 ; Sijen et al., 2001b ; Thomas et al., 2001 ; Wang et al., 2001 ).
Как было описано выше (см. гл. " РНК-интерференция и PTGS: природа сигнала сайленсинга "), метилирование трансгена также коррелирует с распространением сигнала системного сайленсинга.
Метилирование гомологичных последовательностей в ядре обнаруживается при PTGS, вызванном как трансгенами, так и вирусами, реплицирующимися в цитоплазме и не оказывающимися в ядре ( Jones et al., 1999 ).
Метилирование при PTGS ограничено областью гомологии в кодирующей части гена, при этом модифицированными оказывается большое количество остатков цитозина в составе как симметричных так и несимметричных сайтов ( Jones et al., 1998 ).
Несмотря на наличие корреляции между метилированием трансгена и установлением и поддержанием репрессии, а также распространением сигнала системного сайленсинга, до сих пор неизвестно, является ли метилирование причиной или побочным следствием в этих процессах. Гипотеза, согласно которой метилирование необходимо для установления и поддержания PTGS, предполагает, что оно приводит к такому изменению структуры локуса, которое способствует синтезу аберрантных, например, укороченных транскриптов, которые запускают процесс репрессии.
В свою очередь процесс PTGS приводит к метилированию гомологичных последовательностей ДНК, создавая самоподдерживающийся цикл.
Однако не существует данных, свидельствующих о том, что метилирование само по себе приводит к терминации транскрипции, и в работе Wang с соавт. было показано, что накопление преждевременно терминированных транскриптов не связано напрямую с метилированием ( Wang et al., 2001 ).
Уменьшение метилирования было обнаружено при большинстве мутаций, нарушающих PTGS у Arabidopsis ( Dalmay et al., 2000b ; Elmayan et al., 1998 ; Fagard et al., 2000 ; Mourrain et al., 2000 ), в то время как вирусные супрессоры PTGS HC-Pro и 2b вероятно способны подавлять PTGS, не нарушая метилирования ( Beclin et al., 1998 ; Voinnet et al., 1999 ).
Прямые исследования необходимости метилирования для PTGS c помощью его подавления обработкой 5-азацитидином дало противоположенные результаты в двух разных исследованиях ( Kovarik et al., 2000 ; Wang and Waterhouse, 2000 ).
Изучение влияния на PTGS мутаций в генах, необходимых для метилирования, также дало различные результаты в разных системах. В работе Jones c соавт. было показано, что метилирование по симметричным и несимметричным остаткам цитозина, наблюдаемое при вирус-индуцированном PTGS, не наследуется в последующих поколениях (в отсутствии вируса) и не зависит от активности MET1 (метилтрансферазы) , поддерживающей метилирование симметричных СpG-сайтов при TGS ( Jones et al., 2001 ).
Однако при исследовании другого случая PTGS, вызванного трансгенами, было обнаружено нарушение репрессии при мутациях в гене MET1, а также DDM1 , который кодирует субъединицу ремоделирующего хроматин комплекса SNF2/SWI2 и также подавляет метилирование ( Morel et al., 2000 ). Мутации в MET1 и DDM1 приводили к полному снятию TGS в большинстве случаев, однако их эффект на PTGS был различен: мутация в DDM1 приводила к тому, что в 5-20% растений следующего поколения репрессия полностью отсутствовала, в то время как мутация в MET1 приводила к потере репрессии в некоторых частях растения в процессе его роста.
Эти данные позволяют сделать вывод о влиянии метилирования и локальной структуры хроматина на процесс PTGS, при этом активность DDM1 вероятно нужна для установления репрессии, в то время как активность MET1 - для ее поддержания в процессе развития.
Следует отметить, что DDM1, по-видимому, влияет на репрессию через изменение структуры хроматина локуса, а не его метилирования, т.к. известны примеры TGS, при котором репрессия снималась мутацией в DDM1, но не MET1, хотя метилирование нарушалось в обоих случаях ( Mittelsten Scheid O, 1998 ).
Нельзя исключить и непрямого действия мутаций в генах DDM1 и MET1 на PTGS - например, изменение экспрессии клеточных генов, участвующих в PTGS или же общее увеличение количества двухцепочечной РНК, транскрибируемой с различных геномных повторов, которая будет насыщать аппарат репрессии.
Таким образом, несмотря на то, что метилирование обнаруживается практически во всех случаях PTGS, его конкретная роль в качестве причины или следствия репрессии может отличаться в различных системах.
По-видимому, при TGS также существуют 2 класса систем, один из которых не зависит от метилирования ( Vaucheret and Fagard, 2001 , обзор).
Следует отметить то, что метилирование очевидно не нужно для сходного с косупрессией явления - quelling у Neurospora ( Cogoni et al., 1996 ).
