PTGS и TGS: РНК-зависимое метилирование (RdDM)
Ограничение метилирования при PTGS областью гомологии предполагает, что оно напрямую направляется РНК. Впервые РНК-зависимое метилирование (RdDM) (RNA-dependent DNA methylation) было обнаружено при встраивании в геном кДНК копий вироидов, представляющих собой сильно структурированную кольцевую РНК с протяженными участками двухцепочечной РНК. В этом случае репликация вироида, происходящая в ядре, приводила к метилированию кДНК копий вироидов, но не окружающих последовательностей ( Wassenegger et al., 1994 ).
Минимальный размер гомологичной последовательности ДНК, достаточный для РНК-зависимого метилирования вироидами и вирусами составляет около 30 пар нуклеотидов ( Pelissier and Wassenegger, 2000 ; Thomas et al., 2001 ).
TGS , вызванный вирусом, несущим гомологию с промоторной областью трансгена, сопровождался интенсивным метилированием остатков цитозина в составе симметричных и несимметричных сайтов в промоторе трансгена ( Jones et al., 2001 ). Такое транскрипционное подавление экспрессии наследовалось в последующих поколениях в отсутствии вируса, что требовало активности MET1 , однако метилирование сохранялось только в составе симметричных сайтов.
Таким образом, модификация остатков цитозина в составе несимметричный сайтов не поддерживается в отсутствии РНК и может рассматриваться как отличительный признак первичного РНК-индуцированного метилирования ( Jones et al., 2001 ). Открытым остается вопрос, какие именно молекулы РНК направляют метилирование гомологичных последовательностей.
В литературе обсуждается участие в этом процессе как протяженных молекул двухцепочечной РНК , так и коротких siRNA .
RdDM способны вызывать вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме ( Thomas et al., 2001 ), и это свидетельствует о том, что РНК, направляющая метилирование в ядре, отличается от вирусных репликонов.
В работе Wang c соавт. метилирование трансгена, содержащего последовательности вируса-сателлита, было вызвано заражением растения вирусом-помощником, что приводило к репликации последовательностей сателлита и появлением 22-х нуклеотидных siRNA ( Wang et al., 2001 ). При этом метилирование наблюдалось даже в тех тканях, в которые вирус-помощник не мог проникнуть, что свидетельствует о том, что метилирование направляется скорее РНК, являющейся сигналом системного сайленсинга , чем реплицирующейся вирусной РНК.
siRNA являются хорошим кандидатом в направлении RdDM благодаря соответствию своих размеров с минимальной областью, способной подвергаться метилированию, однако их участие ставится под сомнение результатами исследований вирусного супрессора HC-Pro .
HC-Pro приводит к исчезновению siRNA, но не изменяет метилирования гомологичных последовательностей в ядре ( Jones et al., 1999 ; Mallory et al., 2001 ), хотя в работе, где исследовалось влияние HC-Pro в течение длительного периода, было обнаружено частичное уменьшение метилирования ( Llave et al., 2000 ). Возможно, что HC-Pro приводит к исчезновению только цитоплазматических siRNA, не влияя на количество siRNA, локализованных в ядре, которые очевидно и должны направлять RdDM ( Mette et al., 2001 ).
Очевидно, что в первичном РНК-зависимом метилировании участвуют специальные ДНК-метилазы , отличные от MET1, способной только поддерживать метилирование в составе симметричных сайтов.
Предполагаемым кандидатом в индукции RdDM является обнаруженное только у растений семейство белков - хромометилаз , обладающих хромодоменом, присутствующим у многих хроматиновых белков ( Henikoff and Comai, 1998 ).
Было показано, что один из генов хромометилаз - CHROMOMETHYLASE3 (CMT3) , кодирует белок, осуществляющий метилирование остатков цитозина в составе СpXpG и некоторых несимметричных сайтов, и являющийся необходимым для репрессии ретротранспозонов и некоторых эндогенных локусов в геноме ( Lindroth et al., 2001 ).
На примере белка MOF , входящего в состав комплекса дозовой компенсации у дрозофилы, в котором присутствует некодирующая РНК ( Franke and Baker, 1999 ), показано, что хромодомен является РНК-связывающим доменом ( Akhtar et al., 2000 ).
Таким образом, РНК, связанная с хромодоменом, может направлять хромометилазу к гомологичным последовательностям ДНК.
Альтернативная возможность заключается в том, что узнавая гомологичную последовательность ДНК, РНК (одна или в составе белкового комплекса, в который не входит метилаза) меняет локальную структуру хроматина, которая затем узнается de novo метилтрансферазой.
