Механочувствительные каналы E.coli: введение
Большая чась белков плазматической мембраны E.coli клонированы и подверглись молекулярно-биологическому анализу. Чтобы определить биофизический ответ мембраны на механическое воздействие, необходимо использовать технику локальной фиксации потенциала . Она, вкратце, сводится к помещению на мембрану интересующей нас клетки стеклянной микропипетки (диаметр кончика 0,5 мкм). Между кончиком пипетки и плазматической мембраной образуется очень большое электрическое сопротивление (порядка 10 ГОм), что позволяет регистрировать токи амплитудой в диапазоне пикоампер. Микропипетка заполнена электролитом и соединена с соответствующей электрофизиологической аппаратурой, таким образом, чтобы регистрировать токи через мембрану. Последнюю можно оставить in situ или с помощью аккуратного засасывания в пипетку вырвать из клетки и изучать в изолированном состоянии. В обоих случаях можно измерять токи через единичный мембранный канал. К сожалению для специалистов по фиксации потенциала, большинство бактерий слишком малы, для того чтобы экспериментаторы могли показать на них свое искусство. Например, E.coli всего 2 мкм длиной и 1 мкм в диаметре - слишком мало, чтобы можно было выполнить фиксацию потенциала современными методами. Похоже, именно малые размеры прокариот уберегли их от излишнего любопытства со стороны физиологов. Этих ребят, правда, не так легко обескуражить, и обходной путь они все-таки нашли. Раз E.coli слишком мала для физиологов, значит, она должна стать больше! К счастью, существуют методы получения "гигантских" клеток E.coli с помощью антибиотиков. Если, например, культивировать E.coli в цефалексине, аналоге пенициллина, наблюдается репликация ДНК и увеличение размера клетки без клеточного деления. В результате формируются филаменты, похожие на нитки бус, длиной до 100 мкм, которые при обработке раствором ЭДТА с лизоцимом преобразуются в сферы диаметром до 10 мкм. Этот размер уже пригоден для выполнения локальной фиксации потенциала . Единственная проблема - с наружной или внутренней мембраной образует соединение микропипетка, однако исследования показали, что это все-таки внутренняя мембрана. Вероятно, когда поверхность бактерии засасывают для фиксации потенциала внутрь микропипетки, ее кончик разрушает наружную мембрану и клеточную стенку и соединяется именно в внутренней мембраной. Схема такого эксперимента показана на рис. 5.1 .
Обнаружены два типа Мчк (механочувствительных каналов) : МчкВ (каналы высокой проводимости) - с проводимостью порядка 3000 пСи и МчкМ каналы малой проводимости - с проводимостью около 1000 пСи. Если латеральное натяжение фиксируемой мембраны увеличивается вследствие ее всасывания в микропипетку, каналы открываются. То, что высокая и низкая проводимости МчкВ и МчкМ - следствие активности двух разных типов каналов, а не разных состояний одного и того же доказывается с помощью нокаута гена МчкВ . Характеристики проводимости МчкМ определяются именно в таких "нокаутных" бактериях. Натяжение, требуемое для открывания этих каналов, составляет прибл. 0,7 от того, которое необходимо для открывания МчкВ. Существуют и данные о присутствии в мембране каналов с еще меньшей проводимостью. Анализ МчкВ был продолжен с помощью сложной техники современной молекулярной биологии. Метод состоит в включении фрагментов мембраны в липосомы из фосфолипидов другого вида и повторной локальной фиксации потенциала, чтобы подтвердить наличие механочувствительных каналов. Белки из таких липосом могут быть экстрагированы умеренными детергентами и очищены с помощью биохимических методик, каждая стадия тестируется методом фиксации потенциала и так до получения чистой фракции каналов. Выяснилось, что молекулярная масса канала Mr составляет около 17 кДа. N-конец аминокислотной последовательности 17 КДа-белка сиквенирован, а затем в полной к настоящему времени базе данных генома E.coli проведен поиск гена, содержащего соответствующую последовательность нуклеотидов. Эта последовательность была обнаружена в гене, функция которого ранее не была известна. путем сложных молекулярно-биологических процедур ген был экспрессирован, а полученный белок встроен в фосфолипидные липосомы, которые, будучи локально фиксированы по потенциалу, продемонстрировали наличие механочувствительных каналов. Поскольку МчкВ удалось выделить и встроить в искусственные фосфолипидные липосомы, стало возможным детально изучить биофизические характеристики каналов. Как и большинство других мембранных каналов, они обладают различными состояниями проведения ( рис. 5.2 ). Существует и строгая их зависимость от латерального натяжения мембраны. Зависимость вероятности открытого состояния канала от натяжения описывается крутой сигмовидной кривой. Данных об их ионной селективности нет, и это, вместе с большой проводимостью канала, предполагает наличие широкой водной поры .
