Гены млекопитающих, кодирующие белки, ассоциированные с теломеразой
В 1997 г. гены млекопитающих, родственные р80, были идентифицированы нашей группой и группой Харрингтона независимо друг от друга, с использованием одинаковых подходов для разных видов животных. В конце 1995 г. мы обратили внимание на клон EST (Expression Sequence Tag) крысы из банка нуклеотидных последовательностей EST , чья нуклеотидная последовательность обладала ограниченной гомологией с геном р80 Tetrahymena. Мы клонировали полноразмерную кДНК и определили нуклеотидную последовательность, в результате чего пришли к заключению, что этот ген TLP1 крысы (Telomerase Protein 1), является крысиным гомологом гена р80 Tetrahymena [ Nakayama, ea 1997 ]. Предсказанный белковый продукт гена TLP1 состоял из 2629 аминокислот, что значительно больше, чем в случае гена р80 (719 аминокислот). Участки, гомологичные р80, расположены в N-концевой трети белкового продукта, а нуклеотидосвязывающий домен ( мотив Уолкера ) и повторы WD-40 , которые предположительно участвуют в белок-белковых взаимодействиях, образуют центральный и С-концевой домены соответственно. Исходя из этого, белок TLP1 был признан мультифункциональным белком, обладающим дополнительными функциями, не присущими белку р80. Предсказанная аминокислотная последовательность белка TLP1 не содержит ни одного мотива, характерного для ДНК/РНК полимераз, в отличие от р80 Tetrahymena.
Таким образом, мы предположили, что клонированный TLP1 может принимать участие в регуляции теломеразной активности, однако он не является каталитическим компонентом теломеразы млекопитающих. Одной из причин, затрудняющих биохимическое изучение теломеразы млекопитающих, являлось отсутствие чувствительного и количественного метода для определения слабой теломеразной активности у млекопитающих. Простой и чувствительный метод амплификации теломерных повторов TRAP (Telomeric Repeat Amplification Protocol), основанный на ПЦР, был описан в [ Kim, ea 1994 ]. Однако, этот метод являлся качественным или, в лучшем случае, полуколичественным и был мало пригоден для биохимических исследований. Независимо нами на основе ПЦР был разработан другой метод для оценки относительных титров теломеразы, - названный Stretch PCR Assay [ Tatematsu, ea 1996 ]. Мы показали, что этот метод пригоден как для клинической диагностики, так и для фундаментальных исследований. Используя данный метод, нами было показано, что белок TLP1 выделялся вместе с теломеразной активностью в процессе нескольких стадий очистки с использованием различных методов разделения. Более того, анти-TLP1 эффективно связывали теломеразную активность в клеточных экстрактах. Основываясь на этих данных, мы пришли к выводу, что белок TLP1 - белок, ассоциированный с теломеразой. Ген TLP1 экспрессируется почти во всех клетках, в том числе и в клетках, не содержащих теломеразной активности. Следовательно, уровень экспрессии гена TLP1 не влияет на регуляцию теломеразной активности. В опытах с использованием метода вытеснения метки было показано, что белок TLP1 транслируется в клетках с теломеразной активностью как вновь образующийся белок с кажущейся молекулярной массой 240 кДа ( р240 ), а затем процессируется, образуя белок с кажущейся молекулярной массой 230 кДа ( р230 ). Эта модификация происходит относительно быстро; время "полужизни процессинга" составило один час или менее того. Однако, в клетках, не обладающих теломеразной активностью, превращения р240 в р230 не наблюдалось. Отсюда мы предположили, что модификация продукта гена TLP1 может иметь значение для регуляции теломеразной активности. Поскольку TLP1 экспрессируется в клетках, не содержащих теломеразу, р240, помимо функций, связанных с теломеразой. может обладать дополнительными функциями, такими как поддержание теломерных ДНК- белковых структур как в клетках, содержащих теломеразу, так и в клетках, лишенных ее. Исследуя коллекцию мышиных EST, Харрингтон с соавторами независимо обнаружил у мыши и человека гомологи гена р80 - гены ТР1 [ Harrington, ea 1997 ]. Они показали, что у мыши белковый продукт гена ТР1 связывается с матричной РНК теломеразы, как и в случае белка р80 у Tetrahymena. Эти два исследования убедительно продемонстрировали, что р80-гомология сохранилась у широкого круга эукариот, от ресничных инфузорий до человека. Интересно, однако, что в результате поиска на основе опубликованной полной последовательности генома Saccharomyces cerevisiae у почкующихся дрожжей р80-гомология не обнаружена. Теломеразная активность этих дрожжей подробно охарактеризована [ Singer, ea 1994 ]. Таким образом, отсутствие у них гена, родственного р80, указывает на то, что продукты генов, гомологичных р80, возможно, не являются неотъемлемой частью теломеразы подобно каталитической субъединице, но могут принимать участие в видоспецифической регуляции. Гены TLP1 и ТР1, обнаруженные у разных видов, идентичны и в дальнейшем будут обозначаться как ген TLP1/TP1 .
