Теломераза: мутации РНК и ферментативные свойства
Было обнаружено, что специфическая последовательность, возникающая при внесении мутаций в матричную часть теломеразной РНК, влияет на характер теломерной активности. Мутантный ген теломеразной РНК с измененной последовательностью 3-ААССССААС-5' у Tetrahymena приводил к синтезу соответственно измененных теломерых повторов и это свидетельствует о роли матричной последовательности РНК в синтезе теломеры [ Yu, ea 1990 ]. Однако в дополнение к этим ожидаемым изменениям мутации некоторых оснований в матрице РНК также ведут к отличному от нормы поведению теломеразы in vitro, включая различные случаи утраты точности в работе фермента. Например, единственная замена С на U внутри матричной последовательности теломеразной РНК Tetrahymena отменяло способность поддержания теломер in vivo. Теломеры укорачиваются и после 25 клеточных делений, после замены в теломеразе нормальной РНК на мутированную РНК клетки перестают делиться [ Yu, ea 1990 , Giiley, ea 1995 ]. Анализ этих теломер in vitro показал, что они проявляют амально высокий уровень неправильных включений (до 50% при определенных условиях) при копировании смежных остатков матрицы. Помимо включения неправильных оснований у мутантной теломеразы были трудности с кэпированием полноразмерной матрицы: продукт элонгации диссоциировал от матрицы за два нуклеотида до ее конца. Подобная преждевременная диссоциация in vitro в той же позиции характерна и для других точечных мутаций матрицы РНК [ Giiley, ea 1995 ]. Матричные изменения теломеразной РНК S. cerevisiae имеют даже более значительные последствия. Специфическая трехнуклеотидная замена ( tlc 1-476 GUC мутация ) внутри 17-нуклеотидного матричного домена теломеразной РНК ведет к полной потере теломеразной активности in vitro в экстрактах приготовленных из гаплоидных мутантнтных клеток. Эти гаплоидные клетки также прявляют нестабильность теломер и старение, что согласуется с отсутствием теломеразной активности in vivo [ Prcscott, ea 1997 ]. Таким образом, межнуклеотидные взаимодействия в матричном районе дрожжей очень важны для ферментативной функции.
Высококонсервативный набор свойств вторичных структур стал ясен из филогенетически сравнений более 20 теломеразных РНК Ciliatae [ McGormick, ea 1996 ]. Мутации в теломеразной РНК Tetrahymena разрушаюшие эти консервативные части структуры хотя и допускали формирование теломеразных РНП, содержащих измененную телоразную РНК, значительно ослабляли теломеразную активность как in vivo, так и in vitro [Жилли, Т. Уэр, Е.Блэкберн, неопублико[нные результаты). Важная роль внематричной части теломеразной РНК была продемонрирована путем межвидового обмена теломеразными РНК, при котором теломерная РНК ресничатого Glaucoma была экспрессирована клетках Tetrahymena. Теломеразная РНК Glaucoma на ~50% отличается от последовательности теломеразной РНК Tetrahymena во внематричном районе, но 23-нуклеотидная посдовательность самой матрицы идентична у их видов и их вторичные структуры накладыются. Теломеразная РНК Glaucoma встраиется в РНП Tetrahymena и частично функционируует in vitro и in vivo. Однако этот гибдный ферментативный РНП, состоящий из РНК Glaucoma в комплексе с белками Tetrahymena, полимеризует повторы менее процессивно, чем РНП дикого типа, и проявляет отличную от нормы расщепляющую активность [ Bhattacharyya, ea 1997 ]. Эта реакция ошибочного расщепления, проявленная гибридным ферментом, вероятно, является результатом изменений во взаимодейвии РНК и белка, что ведет к смещению активного центра расщепления по отношению сайту связывания праймера/матрицы. Все это вместе взятое позволяет предположить, что аквность теломеразы может контролироваться и регулироваться путем изменения молекурных взаимодействий внутри теломеразного РНП с помощью нематричных областей РНК. В совокупности эти результаты указывают на избычную степень зависимости теломеразы от ее РНК-компонента. РНК не просто копируется обычной обратной транскриптазой (как случае ретровирусов или ретроэлементов). Хотя функционально теломераза и является обратной транскриптазой [ Yu, ea 1990 ] и аминокислотная последовательность ее каталитического домена [ Lingner, ea 1997 ] весьма напоминает последовательность других обратных транскриптаз, тот факт, что тринуклеотидное замещение в 1,3 т.п.н. РНК-компонента дрожжей полностью блокирует ферментативную активность, замечательно демонстрирует то, что РНК также является очень важным компонентом каталитической машины, а не только выступает в качестве матрицы.
