Трансгеноз: методы селекции трансформированных соматических клеток
Основной принцип, используемый при селекции клеток, трансформированных путем введения чужеродной генетической информации, заключается в том, что требуемую конструкцию вводят в клетку вместе с геном маркером, который легко идентифицировать после того, как он попал внутрь трансформируемой клетки. Попадание гена маркера свидетельствует о том, что скорее всего вместе с ним проник и требуемый ген, поскольку они были связаны ковалентно. Возможны два варианта использования маркера.
В первом из них, идеологически и методически более простом, используют так называемую доминантную селекцию . Вам хорошо известен этот принцип. Помните плазмиду pBR322? В ней содержалось два гена устойчивости к антибиотикам. Если плазмида проникает в бактериальную клетку, которая чувствительна к этим антибиотикам, то она становится устойчивой к ним благодаря экспрессии генов устойчивости, содержащихся на плазмиде. Это и есть доминантная селекция в случае бактериальных клеток. Точно такую же селекцию можно использовать и для эукариотических клеток, и мы уже использовали ее, когда вводили в клетку рекомбинантные ретровирусы, содержащие ген устойчивости к неомицину. Клетки, в которые попал рекомбинантный ретровирус становились устойчивыми к этому антибиотику и могли расти на среде, содержащей его. Клетки же, не получившие в свой геном ретровируса, оставались нежизнеспособными на этой среде и погибали.
В другом случае для селекции используют мутантные соматические клетки. Самый общий принцип такой селекции вы можете увидеть на рис. 8 . Выбирают один из путей метаболизма, где некоторый продукт В, без которого клетки погибают, может синтезироваться по двум путям: из предшественника А и предшественника С. Получают мутацию, не позволяющую продукту В образовываться из А. Подбирают ингибитор, препятствующий превращению предшественника С в продукт В. Такие мутантные клетки не могут расти на среде с ингибитором. Однако, если их трансформировать и ввести в них ген, который преодолеет мутацию и позволит продукту В образовываться, то на среде с ингибитором рост клеток, совершенно естественно, будет происходить. Так клетки, трансформированные конструкциями, содержащими ген-преодолитель мутации, можно отличить от нетрансформированных, точнее не просто отличить, а отобрать, селектировать. Если ген, преодолевающий мутацию, ввести в вектор вместе с тем геном, который вы хотите вставить в клетки, то они будут попадать в клетки вместе. Отбирая клетки, способные расти на среде с ингибитором, вы будете со значительной долей уверенности надеяться, что эти клетки содержат и нужный вам ген. Очень часто для создания подходящих мутантов используют метаболические пути синтеза нуклеотидов ( Рис. 9 ). Они хорошо изучены и позволяют осуществлять принцип, о котором мы только что поговорили.
