Трансгеноз для анализа мутаций: методика
Давайте сделаем трансгенную мышь, содержащую какой -либо репликон, способный реплицироваться в бактерии. Это может быть бактериофаг лямбда или плазмида. Вставим в этот репликон какой-нибудь ген-репортер , за которым легко следить. Мутация в нем должна приводить к исчезновению признака, который проявляется диким типом этого гена. В качестве такого гена-репортера чаще всего используют ген lac Z . При использовании гена lac Zмутантные клетки будут давать белые колонии, а рекомбинантные клетки - голубые.
Теперь представим себе, что вы получили голубые рекомбинантные клетки и обработали их мутагеном. Снова рассеяли их на чашку с Х-Gal и увидели: часть клонов остались голубыми, а часть превратились в белые. Какой вывод мы с вами сделаем? Конечно, те, которые побелели, получили повреждение, мутацию в гене b-галактозидазы, который содержится в плазмиде. Можно взять эти белые клоны, выделить из них плазмиду, секвенировать ее и понять, какое именно повреждение получил этот ген.
Метод прост. Теперь посмотрим на Рис. 15 . И обратим внимание на ту его часть, где показана схема с лямбда фаговым вектором, содержащим lac Z ген. Вставим фаговый вектор с lac Z геном в мышиный геном стандартной микроинъекцией. Группу потомков этой трансгенной особи обработаем мутагеном. Другую контрольную группу не станем обрабатывать. И мы хотим знать, как влияет мутаген на мутации ДНК в почках, в сердце, в легких и т.д. Выделим ДНК из опытных и контрольных мышей из этих органов. Добавим к ней упаковочный экстракт, который стандартно используется для упаковки фаговых частиц при клонировании. Если вы не знаете этого, то почитайте в сборнике методик Маниатиса, который вы хорошо знаете, или у Гловера [ Гловер, 1989 ]. В этом упаковочном экстракте содержится фермент терминаза, которая из генома мыши специфически вырежет геном фага лямбда по его cos-участкам (опять сверьтесь с Маниатисом). Вырезанный геном упакуется в вирусные капсидные белки и в результате получится какое- то количество фаговых частичек, способных инфицировать E.coli. Воспользуемся этой способностью, инфицируем lac Z- бактериальные клетки и высеем их на среду с X-Gal. Получим фаговые бляшки. Одни из них будут голубые, это означает, что ген не получил мутации. Другие белые. В них ген мутировал. Сравним количество мутантных и нормальных бляшек для опытной и контрольной групп. Сравним их количества в разных органах. Просто и убедительно. Мы получили элегантный метод исследования мутаций. Аналогично можно поступить, используя в качестве вектора плазмиду. Посмотрите на рис. 16 и сами продумайте схему. Определим частоту мутаций, как отношение числа белых бляшек к к общему числу бляшек.
