Генная терапия: опыты на животных со стволовыми клетками
Естественно, что прежде чем использовать любую технологию на человеке, сначала ее детально изучают на экспериментальных животных. Эта эпопея с экспериментальными животными началась давно. В первых опытах, выполненных в 1980 году, использовали костный мозг из мыши, специально обработанный, чтобы увеличить количество стволовых клеток. А для введения требуемой генетической информации использовали традиционную для того времени технику трансформации с помощью просто ДНК в присутствии фосфата кальция. Все это вводили мыши, получившей летальную дозу радиации, и доказали, что генетически трансформированные клетки там прижились. Эти эксперименты и открыли дорогу современной генной терапии.
Затем уже в 1984 году использовали ретровирусный вектор, опять чтобы ввести новую генетическую информацию в клетки костного мозга. Вероятность переноса этой информации увеличилась на несколько порядков по сравнению с предыдущим способом. Наконец, в 1990 году удалось экспрессировать человеческую аденозиндезаминазу в мыши. Для этого пересаживали костный мозг инфицированный с помощью амфотропного рекомбинантного ретровируса, содержащего ген АДА. Эти эксперименты и проложили путь генной терапии аденозин дезаминазной недостаточности. Эксперименты на мыши были успешными. Они дополнялись экспериментами на других животных, включая приматов. Данные, полученные на приматах, наиболее информативны для целей переноса их на человека. И в этом случае первые опыты ставились с геном аденозиндезаминазыи и с костным мозгом. Примерно по такой схеме: костный мозг брали у макак-резусов. Стволовые клетки мозга размножали путем добавления цитокинов, обогащали по CD34 стволовым клеткам, ко-культиворовали с пакующей линией клеток, продуцирующей рекомбинантный ретровирус, содержащий ген ADA и вводили обратно обезьянам. Вывод из этих опытов следовал полуоптимистический: стволовые клетки могут быть использованы для переноса генетической информации с помощью ретровирусов, но содержание рекомбинантных клеток с нужным геном в общем пуле достаточно низко - около 1%. И это было отличием от аналогичных опытов с мышами, где частота рекомбинантных лимфоцитов с той же аденозиндезаминазой достигала 40%. Разница мышь - обезьяна оказалась очень большой.
Далее совершенствовали методологию в двух направлениях. Во-первых, увеличивая эффективность переноса требуемого гены в клетки костного мозга за счет использования паковочных линий, дающих очень высокий титр рекомбинантных ретровирусов. Это давало возможность повысить вероятность попадания ретровируса в клетку просто за счет большего числа ретровирусных частиц, окружающих клетку в процессе трансфекции. С другой стороны, старались обогатить препараты костного мозга именно стволовыми клетками. После таких усовершенствований количество рекомбинантных клеток в общем пуле удавалось увеличить до 10%. Таким образом, содержание требуемых клеток можно увеличивать. Другим способом увеличения доли нужных клеток в могут стать методы, увеличивающие селективные преимущества требуемых клеток по сравнению с теми, которые стараются заместить. Однако, по-видимому, это не всегда возможно и, следовательно, необходимо дальнейшее увеличение эффективности трансформации и разработка методов обогащения стволовых клеток. По технологии, описанной выше, уже проводятся эксперименты на пациентах, страдающих ADA недостаточностью.
