Таргетинг: использование гена дифтерийного токсина

Геном, широко используемым в последнее время, является фрагмент гена дифтерийного токсина, кодирующего А-цепь ( DT-A ). Продукт этого гена токсичен для эукариотических клеток за счет ингибирования синтеза белка. Отсутствие В-цепи, имеющейся в природном токсине и содержащей сигнальный пептид, приводит к тому, что DT-A удерживается в цитоплазме синтезирующих его клеток и не убивает соседние. Апробированный первоначально на модели трансгенных мышей ( Polmiter R.D., ea., 1987 ), этот ген нашел в дальнейшем свое применение и в процедуре таргетинга. Вектор, содержащий ген DT-A, впервые был использован в работе T.Yagi и соавт ( Yagi T., ea., 1990 ). В этом векторе транскрипция гена DT-A осуществлялась за счет регуляторных элементов вируса полиомы (энхансер) и гена tk HSV (промотор). Однако ген не содержал сайта полиаденилирования, что должно предотвращать его транзиентную экспрессию. Одновременно положительная селекция осуществлялась геном neo, который содержал сайт полиаденилирования, но не имел промотора и энхансера. Клоны с гомологичной рекомбинацией выявлялись на среде с G418 ( рис. 3 ). При случайной интеграции с активно транскрибирующимися участками ген neo попадал под действующий промотор, а ген DT-A получал сайт полиаденилирования, что приводило к гибели клонов. При случайной инсерции вектора в неактивные области генома отрицательная селекция осуществлялась за счет гибели клеток на среде с G418, поскольку беспромоторный ген neo в этих случаях не работал. Авторы использовали эту стратегию для таргетинга гена с-fyn и обнаружили, что использование гена DT-A обогащает получаемые клоны ЭС-клеток рекомбинантами примерно в 10 раз.

Возможны и другие варианты использования гена DT-A для отрицательной селекции. Так, иногда оба маркерных гена содержат промотор, в качестве которого служит регуляторная область гена G- актина ( Tomasiewicz H., ea., 1993 ). McCarrick и соавт. ( McCarrick J.M., ea., 1993 ) сконструировали кассету, в которой ген DT-A снабжен промотором, сходным с ранее детально описанным в кассете pMCLneo, и сайтом полиаденилирования из вируса SV40. Специально проведенные эксперименты показали, что транзиентная экспрессия содержащегося в кассете гена DT-A не приводит к существенной неспецифической гибели ЭС-клеток, тогда как при стабильной интеграции вектора за счет негомологичной рекомбинации продукт гена DT-A обеспечивает селективную гибель. Использование такого вектора обеспечивало обогащение таргетированными клонами в 9-29 раз. Эта величина существенно не отличается от того обогащения, которое достигалось при использовании гена tk HSV. Сходное обогащение было получено и в других работах, в которых для отрицательной селекции использовался ген DT-A ( Le Mouellic H., ea., 1992 ; Picciotto M.R., ea., 1995 ). Замена гена tk на ген DT-A в целом упрощает ситуацию, поскольку для отрицательной селекции не требуется добавления никаких селективных агентов, которые могут влиять на жизнеспособность клеток и целостность генетической системы.

Ссылки: