Таргетинг: использование рекомбинационной системы бактериофага PI
Существенное развитие метод таргетинга получил в результате использования рекомбинационной системы cre - loxP бактериофага PI ( Gu H., ea., 1994 ).
Стратегия этой принципиально новой схемы изображена на рис .4 . В данном случае для таргетинга используются 2 линии мышей:
1) мыши с трансгеном cre, экспрессирующимся в ткане- или стадиеспецифической манере благодаря подбору соответствующего промотора и
2) мыши, содержащие таргетированный ген, который фланкирован с двух сторон сайтами рекомбинации loxP (так называемый флоксированный ген ), но нормально функционирует.
Для того чтобы таргетинг не нарушал экспрессию таргетируемого гена, сайты loxP и кассету с геном neo встраивают в вектор во фланкирующие области гена. У гибридов, возникающих при скрещивании таргетированных мышей с трансгенными мышами, содержащими ген cre, в результате действия cre- loxP- зависимой рекомбинации осуществляются 2 типа делеций таргетированного гена в тех типах тканей и на тех стадиях развития, когда происходит экспрессия трансгена cro. Авторы предложенной стратегии для специфической делеции гена полимеразы в Т-лимфоцитах скрещивали мышей с флоксированным геном с трансгенными животными, у которых экспрессия гена cro осуществлялась под контролем промотора гена lck, специфически функционирующего в Т-клетках. В результате были получены мыши с "нокаутированным" (делетированным) геном только в одном типе клеток. Такой подход значительно расширяет возможности таргетинга, поскольку позволяет изучать функцию гена в отдельных тканях и на определенных стадиях развития, и способствует преодолению основной трудности, с которой часто сталкиваются исследователи в традиционном подходе - летальности, возникающей при null - мутациях.
Еще большие возможности для преодоления ограничений дает вариант метода с использованием индуцируемой инактивации гена ( Kuhn R., ea., 1995 ). Для реализации этого варианта получали мышей, содержащих флоксированный ген- мишень и ген cre, контролируемый промотором гена Mxl . Поскольку промотор гена Mxl индуцируется под действием интерферона, после инъекции последнего наблюдали 100% делецию гена-мишени в печени трансгенных мышей.
Интересный вариант таргетинга, при котором происходит инактивация одного из генов с одновременным введением на его место другого функционирующего гена, получивший название " knock-in ", предложен недавно M.Hanks и соавт. ( Hanks M., ea., 1995 ).
При таргетинге гена En-1 с помощью вектора, содержащего сходный по структуре ген En-2 и ген neo, фланкированный loxP, происходило нокаутирование гена En-1 с одновременным замещением его кодирующим участком гена En-2. В результате ген En-2 начинал экспрессироваться в тот же временный интервал, что и нокаутированный ген En-1, хотя в норме при эмбриогенезе ген En-2 экспрессируется на более поздних стадиях развития. Поскольку смещение времени экспрессии En-2 компенсировало у трансгенных мышей потерю En-1, был сделан важный вывод о том, что белки млекопитающих могут приобретать новые функции не только через дивергенцию структуры, но и в результате дивергенции экспрессии генов.
