Таргетинг: использование тартегируемого гена для селекции
Одна из первых систем отбора клонов ЭС-клеток , с помощью которой удалось обнаружить гомологичную рекомбинацию и которая стала прототипом большинства последующих, была отработана на примере гена гипоксантинфосфорибозилтрансферазы (hprt) мыши ( Thomas K.R., ea., 1987 ).
С этой целью был впервые сконструирован вектор, в котором ген neo (неомицинфосфотрансферазы), обеспечивающий устойчивость к антибиотику G418 , был внедрен в один из экзонов клонированного фрагмента гена hprt. Появление продукта гена neo в клетках тестировали по их резистентности к антибиотику (положительная селекция). Следовательно, при любом типе рекомбинации такого вектора с хозяйским геномом клетки приобретают фенотип G418. Поскольку ЭС-клетки, происходящие из эмбрионов самцов, гемизиготны по гену hprt, расположенному в Х-хромосоме, то для его инактивации требовалась единичная гомологичная рекомбинация, в результате которой в единственном клеточном гене hprt появлялась нарушающая его экспрессию вставка гена neo. Hprt-мутанты легко выявлялись на селективной среде по резистентности к 6-тиогуанину (6-TG) . Среди каждой 1000 G418 -клонов, выявленных при переносе такого вектора в ЭС-клетки, примерно 1 одновременно характеризовался и фенотипом 6-ТG . Двойная резистентность клеток (G418 , 6-TG ) свидетельствовала о таргетировании гена в результате гомологичной рекомбинации, что и было подтверждено последующим более детальным молекулярным анализом.
Принципиальным моментом в работе K.R. Thomas и M.R. Capecchi ( Thomas K.R., ea., 1987 ) было использование для гомологичной рекомбинации как векторов замещения, так и инсерционных векторов (см. рис.1 ). При этом оказалось, что эффективность гомологичной рекомбинации для обоих классов векторов была примерно одинаковой. В дальнейшем, однако были получены данные, свидетельствующие о более высокой эффективности с векторами инсерции ( Hasty P., ea., 1991 ). Для оптимизации экспрессии селектируемого гена neo эти авторы сконструировали специальную кассету pMCLneo, в которой последовательности, кодирующие белок neo, были взяты из бактериального транспозона Tn5, а в качестве промотора и энхансера были использованы соответственно промотор гена тимидинкиназы (tk) простого вируса герпеса (HSV) и 2 искусственно синтезированные последовательности энхансера вируса полиомы PyF441. Для нормальной инициации трансляции транскрипта перед кодирующей последовательностью вставляли синтетическую последовательность с AUG-кодоном. Роль сайта полиаденилирования (pA) в данном случае выполнял соответствующий сайт гена hprt.
В описанном выше примере сам тартегируемый ген служил в качестве селективного маркера. Для тартегирования неселектируемых генов был разработан метод позитивно-негативной селекции ( Mansour S.L., ea., 1988 ).
