Нокаут гена гипоксантингунинфосфорибозилтрансферазы в стволовых клетках
Вот теперь мы готовы продолжить нашу работу с эмбриональными стволовыми клетками и с попыткой нокаутировать ген гипоксантингунинфосфорибозилтрансферазы. Вы теперь уже, наверное, поняли, почему эти нокаутированные клетки неспособны расти на среде HAT . Но зато они будут расти на среде с 6-тиогуанином (6TG).
Авторы работы, о которой мы говорим, сконструировали специальные векторы для направленного встраивания в геном. Эти векторы показаны схематически на рис 7 . Рассмотрим тот из них который показан на рис. 7А. Это так называемый вектор замещения . Его иногда называют векторами W-типа . Просто потому, что в виде, показанном на рисунке, он похож на W. Он содержит 10 000 - 15 000 пар оснований ДНК, гомологичной гену, который собираются замещать. Далее будем называть его ген-мишень. Внутри этой гомологичной последовательности расположен ген маркер neor.
Для того чтобы устойчивость к неомицину проявлялась в клетках, которые встроили этот ген, он должен экспрессироваться. Для этой цели к гену были присоединены необходимые для его экспрессии регуляторные элементы [ Thomas ea 1987 ] :
- промотор гена тимидинкиназы вируса простого герпеса
-Энхансер вируса полиомы
-Синтетическая последовательность, содержащая сигнал инициации трансляции с инициирующим кодоном ATG.
Это можно увидеть на рис. 10 .
Вы конечно уже задали себе вопрос: Для того чтобы ген экспрессировался нормально, он должен помимо этих трех элементов, содержать еще и сигнал полиаденилирования. В данном случае авторы расчитывали, что при гомологичной рекомбинации этот сигнал будет присоединяться к гену neo от разрушенного гена hprt.
Для того чтобы такой вектор мог встроиться в ген, должна произойти двойная рекомбинация по гомологичным участкам. Это двойное событие условно показано на рис. 7 двумя линиями, идущими от геномной ДНК к ДНК вектора. При встраивании векторная ДНК замещает гомологичный район геномной ДНК и вносит в нее ген устойчивости к неомицину.
Если встраивание прошло гомологично, то получается структура, изображенная в нижней части рисунка, и полученные клетки должны проявлять фенотип neor 6TGr. Отбирая такие клетки, можно с высокой вероятностью получить те, которые содержали разрушенный ген hprt.
То что вы прочли, было связано с замещением гена и осуществлялось с помощью вектора замещения. В результате из генома вырезался фрагмент ДНК, и на его место вставлялся фрагмент другой ДНК
