Иммунологические анализы домашних животных
Иммунологические анализы - это процедуры, в которых используется взаимодействие между антителом и антигеном с целью качественного или количественного обнаружения определенных веществ. Иммуносорбентный анализ с ферментной меткой (твердофазный иммуноферментный анализ, тест ELISA ) - это разновидность иммунологического анализа, при котором измеряемый сигнал вырабатывается ферментом и его реакцией с сигнальным веществом (субстратом). Ферментный иммунологический анализ в большинстве случаев используется поочередно с иммуносорбентным анализом с ферментной меткой ( табл. 1(vet2) ). Иммуносорбентные анализы с ферментной меткой часто используются для обнаружения антигенов, антител или комплексов антител и антигенов, ассоциируемых с инфекционными агентами. Однако существует возможность разработки методики иммуносорбентного анализа с ферментной меткой с целью обнаружения любой субстанции, против которой можно выработать специфическое антитело.
В зависимости от конкретного анализируемого вещества и типа иммуносорбентного анализа с ферментной меткой антиген или антитело бывают связанными с твердой фазой. Как правило, твердой фазой являются пластические ячейки пластины (панели) микротитратора иммуносорбентного анализа с ферментной меткой (как правило, полистирол) или мембрана (обычно нитроцеллюлоза). Материал, который может содержать анализируемое вещество, добавляют к твердой фазе для того, чтобы могла произойти первичная реакция между антигеном и антителом. После этого добавляют систему обнаружения с ферментной меткой (конъюгату) для выявления первичной реакции антигена и антитела. Если конъюгата оказывается связанной, это свидетельствует о том, что произошла первичная реакция антигена и антитела. При добавлении сигнального вещества изменяется цвет ( рис. 1(vet2) ).
В системах обнаружения иммуносорбентного анализа с ферментной меткой (твердофазного иммуноферментного анализа) могут использоваться моноклональные или поликлональные антитела , которые бывают гетерогенными (различные виды) или гомогенными. В ходе анализа используются множественные ферменты и субстраты. Существуют различные потенциальные производные иммуносорбентного анализа с ферментной меткой, включая прямой, косвенный анализ, анализ по типу "сэндвич" ( рис. 2(vet2) ), а также конкурентный анализ ( рис. 3(vet2) ). Результаты иммуносорбентного анализа с ферментной меткой можно оценивать визуально путем сравнения изменения цвета анализируемых образцов с цветом контрольных образцов или путем определения степени абсорбции при помощи спектрофотометра. При использовании спектрофотометра результаты можно определить путем неоднократного (кинетического) измерения параметров реакции или измерения в определенный период времени (конечная точка). Результаты могут быть выражены в титрах или других единицах, например процент иммуносорбентного анализа с ферментной меткой (ELISA), активность фермента, активность антитела или удельная концентрация измеряемой субстанции. Титр - это обратная величина степени наиболее полного растворения образца, при котором наблюдается предопределенная положительная реакция в ходе иммунологического анализа с ферментной меткой. Как правило, нельзя напрямую сравнивать выраженные в титрах результаты различных анализов или анализов, выполненных разными лабораториями.
Невозможно делать общие выводы относительно чувствительности, специфичности, предсказанных значений и точности иммуносорбентных анализов с ферментной меткой по сравнению с другими видами анализов или даже другими видами этого же анализа, при которых проводится обнаружение одной и той же субстанции. Использование различных антител, буферных генов (буферов), твердых материалов, субстратов и инкубационных периодов резко изменяет результаты иммуносорбентного анализа с ферментной меткой. Результаты каждого отдельного анализа необходимо подтверждать. При появлении новых методов иммуносорбентного анализа с ферментной меткой или других видов иммунологического анализа специалисту-ветеринару необходимо их критически оценить и лишь затем использовать на практике.
При оценке самого иммуносорбентного анализа с ферментной меткой понятие аналитической чувствительности определяет минимальное количество субстанции, которую можно обнаружить и точно измерить. Аналитическая специфичность показывает, вступает ли обнаруженная субстанция в перекрестную реакцию с другими субстанциями. Диагностическая чувствительность - это соотношение положительных результатов исследований известных зараженных животных. Диагностическая специфичность - соотношение отрицательных результатов исследования известных незараженных животных. Предсказанное значение положительного исследования - это вероятность того, что животное с положительной реакцией заболеет. Предсказанное значение отрицательного исследования - это вероятность того, что животное с отрицательной реакцией является нормальным. Чем ниже распространенность заболевания, тем ниже предсказанное значение положительного исследования. Эта концепция имеет большое значение для клиницистов, поскольку количество случаев ложной положительной реакции возрастает при исследовании популяций, в незначительной степени подвергающихся опасности заражения изучаемым заболеванием. Распространенность заболевания оказывает незначительное влияние на отрицательные предсказанные значения.
В следующем разделе приводится краткое описание систем обнаружения антител и антигенов, основанных на иммуносорбентном анализе с ферментной меткой и применяемых ветеринарными врачами для лечения домашних животных.
