Получение и хранение РНК
При получении РНК ее неустойчивость и повсеместное распространение рибонуклеаз требуют специальных мер предосторожности. Имея дело с пробой, нужно надевать перчатки. Твердые ткани следует мгновенно заморозить. Однако при невозможности мгновенного замораживания следует провести экстракцию РНК в лаборатории в течение 1-4 часов. РНК будет стабильной в твердых тканях при температуре 23-25*С только в течение пяти минут и всего один час - при температуре 2-8*С. Твердые ткани для последующего РНК-анализа не должны храниться долго при -20*С, но при -70*С они сохранияют стабильность в течение двух лет. Для длительного хранения обработанной РНК лучше всего хранить ее в виде осадка в этаноле при -70*С, при этой температуре она будет стабильна в течение неопределенного времени. РНК должна храниться в стерильных гидрофобных пластмассовых пробирках, к которым можно прикасаться только в перчатках и на которые лучше воздействовать диэтилкарбонатной водой, чтобы в пробирках не было рибонуклеаз, являющихся стабильными, убиквитарными (повсеместно распространенными) протеинами и функционирующих без кофакторов. Наиболее распространенным источником рибонуклеаз является кожа, и поэтому все работы с РНК нужно производить в перчатках.
РТ-ПЦР является широко распространенным методом изучения мРНК , полученных из препаратов опухоли. мРНК получают из клеток крови, клеток костного мозга или клеток опухоли при помощи гуанидия тиоцианат-фенол-хлороформного метода или его разновидностей. После этого мРНК превращаются в кДНК с помощью особых праймеров и обратной транскриптазы. Затем кДНК амплифицируют ПЦР-методами, и после гель-электрофореза продукта ПЦР количество РНК определяют либо по окрашиванию бромида этида и исследованию в ультрафиолетовых лучах, либо по анализу Саузерн-блота с маркированными гибридизационными пробами.
