Эвикция гена
Клонирование мутантных аллелей. В ранних работах для клонирования аллелей, полученных традиционными способами мутагенеза, создавали банк генов в лямбда-векторах на основе ДНК мутантного штамма, и затем выделяли нужный рекомбинантный клон по гибридизации бактериальной колонии с пробой гена дикого типа. Так, например, были клонированы две мутации в гене CYC7 ( Montgomery et al., 1982 ). Этот способ трудоемок и не позволяет клонировать большое количество мутантных аллелей. В дальшейшем был разработан более простой метод, который применяют, если известна рестрикционная карта гена и проклонирована аллель дикого типа. Плазмиду с проклонированной аллелью дикого типа интегрируют с хромосомой, возникает дупликация. Затем выделяют ДНК из трансформантов и рестрицируют ее таким образом, чтобы последовательность плазмиды была вырезана вместе с мутантной копией гена. Этот фрагмент выделяют, лигируют и в результате получают плазмиду с мутантной аллелью гена. Таким образом были клонированы аллели гена his4 c инсерцией транспозона и аллель ura3 -52 ( Winston et al., 1983 ; Rose, Winston, 1984 ), и могут быть проклонированы любые фрагменты генома. Так например, с помощью этого метода из хромосомы вырезали фрагменты с областями инсерции транспозона Ту ( для выявления последовательности нуклеотидов на стыке Ту и гена CAN1 ). Положение инсерции Ту-элемента в гене CAN1 определяли с помощью рестрикционного картирования. Мутант саn1 с инсерцией Ту трансформировали плазмидой, линеаризованной по сайту ЕcoR1 в гене CAN1, отбирая трансформанты по маркеру вектора . После этого вырезали фрагмент, подбирая набор рестриктаз в зависимости от расположения транспозона по отношению к сайту инсерции плазмиды ( Wilke et al., 1989 ). Еще обин способ - отбор конвертантов из хромосомы на автономно реплицирующуюся плазмиду. Для этого из плазмиды перед трансформацией вырезают часть гена в области, перекрывающейся с сайтом мутации в хромосомной копии гена. Репарация бреши происходит за счет рекомбинации с хромосомой, и в плазмиде оказывается мутантная копия гена ( Aguilera, Klein, 1990 ).
