3'-RACE (Быстрая амплификация 3'-концов кДНК)
Для определения положения 3'-концов РНК использовали процедуру быстрой амплификации 3'-концов (Rapid 3'-Ends Amplification). 10 мкг тотальной РНК смешивали с 40 пкмоль 5'-преаденилированного дезоксирибонуклеотидного адаптора (New England Biolabs) и 200 ед. усеченной T4-РНК-лигазы 2 (New England Biolabs) в 50 мМ tric-HCl pH 7.5, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT, 10% PEG. Реакцию проводили в течение 1 ч при 25*С и затем останавливали нагреванием до 60*С в течение 25 мин. 5 мкл полученной РНК использовали в качестве матрицы для постройки кДНК со 100 ед. Superscript III (Invitrogen) точно как описано в "разделе 5'-RACE" с использованием праймера, комплементарного адаптору. 2 мкл полученно кДНК использовали как матрицу для ПЦР амплификации (один праймер комплементарен адаптору и второй - матричной цепи гена mccA ). ПЦР продукт клонировали, используя pGEM-T Easy PCR ligation kit (Promega) в соответствии с инструкциями производителя. Из клонов, содержащих вставку, выделяли плазмиды и определяли нуклеотидную последовательность. Положение 3'-конца определяли по месту стыка последовательности адаптора с последовательностью кластера генов mcc .
