5'-RACE (Быстрая амплификация 5'-концов кДНК)
20 мкг тотальной РНК обрабатывали свободной от РНКаз ДНКазой I (New England Biolabs) в соответствии с инструкциями производителя. К половине образца (10 мкг) затем добавляли 5 ед. кислой пирофосфатазы табака (TAP) - +TAP реакция. К образцу -TAP добавляли вместо фермента равный объем воды. Реакционные смеси инкубировали в течение 1 ч при 37*С в объеме 25 мкл с добавлением 20 ед. ингибитора РНКаз RNaseOUT (Invitrogen). После этого РНК экстрагировали кислым фенолом с хлороформом (1:1) и переосаждали спиртом. Осадок растворяли в 50 мкл лигазного буфера (50 мМ tricHCl pH 7.5, 10 мМ MgCl2, 1 мМ DTT) со 120 ед. T4-РНК-лигазы и 50 пкмоль рибонуклеотидного адаптора (5'-gguauugcgguacccuuguacgc-3') и лигировали при 16*С в течение ночи. После фенольной экстракции и переосаждения осадок РНК растворяли в 10 мкл воды, добавляли 1 пкмоль ДНК ген-специфичного ДНК праймера, нагревали смесь до 65*С 5 мин и затем переносили на лед на 10 мин. После отжига праймера добавляли смесь обратной транскриптазы Superscript III (Invitrogen) в реакционном буфере из расчета 100 ед. на реакцию объемом 10 мкл, и проводили удлинение праймера в течение 55 мин при 55*С. 2 мкл полученной кДНК использовали для ПЦР амплификации с ген-специфическим праймером и ДНК-праймером, комплементарным рибонуклеотидному адаптору. Амплифицированные фрагменты разделяли на 2%-ом агарозном геле и вырезали полосы, в которых наблюдалось увеличение количества продукта в +TAP образце. Такие фрагменты клонировали в pT7 Blue вектор (pT7 Blue perfectly blunt cloning kit, Novagen). Определяли последовательность вставок из нескольких рекомбинантных плазмид, используя стандартный T7-promoter праймер, позицию 5'-конца транскрипта определяли по местоположению стыка между рибонуклеотидным адаптором и последовательностью mcc.
