trp Оперон E. coli и другие опероны биосинтеза аминокислот энтеробактерий
Понятие аттенюации было впервые введено Чарльзом Яновским для описания механизма регуляции триптофанового оперона E. coli [ Yanofsky, 1981 ; Kolter, 1982 ], и мы начнем рассмотрение аттенюаторов именно с этой классической системы.
Оперон trpEDCBA E. coli кодирует ферменты биосинтеза триптофана . Этот биосинтетический путь является весьма энергозатратным для клетки, и используется только в случае нехватки триптофана в среде [ Merino, 2008 ]. Экспрессия этого оперона регулируется двумя независимыми механизмами. Первый механизм - регуляция инициации транскрипции ДНК-связывающим репрессорным белком TrpR [ Kelley, 1982 ]. TrpR также связывает триптофан. В связанной с триптофаном форме TrpR связывается с оператором , который пересекается с триптофановым промотором . Связывание репрессора физически блокирует посадку РНКП на промотор и таким образом не позволяет произойти инициации транскрипции генов trpEDCBA.
В условиях избытка триптофана репрессия за счет действия TrpR приводит 80-кратному снижению уровня транскрипции trp оперона по сравнению с уровнем транскрипции, наблюдаемым в отсутствие триптофана [ Yanofsky, 1984 ]. Тем не менее в клетках, где ген, кодирующий TrpR, удален или мутирован, все еще можно наблюдать индукцию триптофанового оперона в ответ на недостаток триптофана.
Эта индукция, которая, очевидно, не связана с TrpR, происходит за счет аттенюации транскрипции . Аттенюация транскрипции позволяет прекратить продолжение синтеза trpEDCBA транскриптов в присутствии триптофана, если инициация транскрипции все же произошла в то время, когда репрессор диссоциировал от оператора. Два механизма, регуляция инициации транскрипции посредством TrpR и аттенюация транскрипции, работают независимо, и эффективность каждого из них определяется концентрацией триптофана в цитоплазме. Учитывая максимальный 80-кратный уровень репрессии на уровне инициации транскрипции и 8-кратный на уровне аттенюации, совокупно клетка получает возможность обеспечить приблизитльно 600-кратное изменение уровня экспрессии триптофанового оперона в зависимости от внутриклеточной концентрации триптофана [ Gollnick, 2002 ; Yanofsky, 1984 ].
Аттенюация триптофанового оперона происходит следующим образом. Лидерный транскрипт trp длиной 141 п.о. содержит четыре области (1, 2, 3 и 4), которые могут формировать три взаимоисключающие шпилечные структуры ( Рис. 3 ): паузирующую (1:2), антитерминатор (2:3) и терминатор (3:4). Этот транскрипт также кодирует лидерный пептид длиной 14 аминокислот, содержащий два триптофановых остатка, расположенных друг за другом. Рамка считывания этого пептида находится перед аттенюатором и частично перекрывается с областью 1.
Вскоре после инициации на новосинтезированной РНК формируется паузирующая структура, образованная комплементарными областями 1 и 2 [ Landick, 1985 ]. В паузированном комплексе сайт связывания рибосомы перед геном trpL уже синтезирован и открыт для посадки рибосомы, поэтому на нем может произойти инициация трансляции. В ходе трансляции лидерного пептида рибосома разрушает вторичную структуру 1:2, что позволяет РНКП продолжить транскрипцию, которая оказывается сопряженной с трансляцией лидерного пептида. Так как открытая рамка считывания лидерного пептида содержит два последовательно расположенных триптофановых кодона, лежащих в области 1, в зависимости от внутриклеточной концентрации триптофана возможны два варианта дальнейшего развития событий.
Если вследствие низкого уровня триптофана в клетке возникает дефицит аминоацилированной триптофановой тРНК , движение рибосомы задерживается на тандеме триптофановых кодонов. Так как РНКП продолжает элонгацию, сопряжение транскрипции и трансляции нарушается, и насцентный транскрипт за областью 1 оказывается не занят рибосомой. В результате формируется антитерминаторная структура 2:3. Эта структура сама по себе не влияет на скорость элонгации , и РНКП продолжает элонгацию и синтезирует полноразмерный транскрипт, кодирующий ферменты биосинтеза триптофана.
Если же в клетке достаточно триптофана и, как следствие, аминоацилированной триптофановой тРНК, рибосома не задерживается на тандеме триптофановых кодонов, а продолжает двигаться в сопряжении с РНКП до конца рамки считывания лидерного пептида. Транслирующая рибосома закрывает собой область 2, расположенную сразу за стоп-кодоном лидерного пептида, но оставляет свободной область 3, расположенную ниже по ходу транскрипции. Таким образом формирование антитерминатора 2:3 блокируется. Так как последовательность области 3 комплементарна последовательности области 4 аттенюатора, образуется шпилька 3:4, которая является частью фактор-независимого терминатора. Под действием этого терминатора транскрипцию trp оперона прекращается и, таким образом, синтезируется лишь короткая РНК, не содержащая генов биосинтеза триптофана.
Сходным образом организован контроль экспрессии многих других оперонов энтеробактерий, отвечающих за биосинтез аминокислот, таких как гистидин, фенилаланин, лейцин, треонин, изолейцин. Принципиально механизмы регуляции идентичны, с очевидной заменой в открытой рамке считывания лидерного пептида тандема триптофановых кодонов на несколько (до шести), расположенных подряд кодонов, узнающихся соответствующими аминоацилированными тРНК [ Yanofsky, 2000 ]. Описанный механизм консервативен среди протеобактерий, а также встречается у некоторых грамположительных бактерий [ Vitreschak, 2004 ].
