Исследование оперона микроцина C: Нозерн-блот гибридизация
Образцы РНК, выделенной, как описано выше, разводили формамидным буфером для нанесения (95% формамид, 0.025% бромфеноловый синий, 0.025% ксиленцианол) до концентрации 0.25 мкг/мкл и наносили 1 мкг РНК на 10%-й денатурирующий полиакриламидный гель (10% акриламид:бискариламид (19:1), 1xTBE (трис 89 мМ, борная кислота 89 мМ, EDTA 2 мМ, pH 8.0), 8M мочевина). Электрофоретическое разделение проводили в 1xTBE буфере течение 15-20 мин при мощности 10 Вт, после чего РНК переносили на мембрану Hybond XL (Amersham) посредством системы для мокрого переноса (BioRad) в течение 1 ч при силе тока 250 мА в 0.5xTBE. Затем мембрану подсушивали на воздухе и запекали в УФ-кросслинкере (UVP), используя настройку "оптимальная сшивка". Мембрану блокировали в течение 30 мин при 37*С в буфере для гибридизации ExpressHyb (Clontech), после чего добавляли 20 пкмоль 5'-32P-меченого олигонуклеотидного зонда и проводили гибридизацию еще в течение часа при 37*С. Мечение зонда проводили полинуклеотидкиназой фага T4 (T4-PNK, Fermentas) с использованием гамма-32P-АТФ в соответствии с рекомендациями производителя. После гибридизации несвязавшийся зонд отмывали дважды по 10 мин в буфере 2xSSC, 0.1% SDS и один раз 10 мин в буфере 0.1xSSC, 0.1% SDS (20xSSC:3 M NaCl, 300 мМ Na цитрат, pH 7.0). Результаты визуализировали на приборе Storm Phosphoimager (GE Healthcare).
