Исследование оперона микроцина C: транскрипция in vitro
Промоторные комплексы формировали в течение 10 мин при 37*С в объеме 10 мкл. Реакции содержали 40 мМ tris-HCl, pH 8.0, 40 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 100 nM E. coli РНКП - сигма70 холофермента (Epicentre) и 10 нМ ДНК-матрицы, содержащей промотор Т7 А1 с модифицированной последовательностью начального транскрипта (-67+30) (tccagatcccgaaaatttatcaaaaagagt(attgact)taaagtctaacctatag(gatactt)acagccA tcgagagggccacggcgaacagcaaccca, где -35 и -10 последовательности промотора выделены скобками, стартовый нуклеотид выделен заглавной буквой, слитый с исследуемым фрагментом. После формирования промоторных комплексов добавляли 10 мкМ CpApUpC, по 25 мкМ ATP и GTP, и 0.33 мкМ альфа?-32P-CTP (3000 мКи/ммоль) и формировали остановленные элонгационные комплексы в течение 5 мин при 37*С. Для возобновления элонгации смесь разводили в десять раз, со следующими финальными концентрациями компонентов: 500 мМ KCl, по 2.5 мкМ ATP и GTP, по 10 мкМ UTP и CTP. Реакции инкубировали еще 15 мин при 25*С и останавливали добавлением равного объема формамидного буфера.
Для транскрипционной реакции сопряженной с in vitro трансляцией остановленные элонгационные комплексы формировали как описано выше, но с заменой хлорида калия на хлорид натрия, т.к. избыток ионов калия ингибирует трансляционную реакцию. Остановленные элонгационные комплексы разбавляли в 10 раз компонентами системы in vtiro трансляции (PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit, New England Biolabs) и проводили сопряженную реакцию транскрипции-трансляции при 25*С в течение 15 мин. Реакцию останавливали добавлением 100 мкл ASE буфера (0.3 М NaAc, pH 5.3, 0.5% SDS, 5 мМ EDTA), дважды экстрагировали смесью кислого фенола с хлороформа (1:1) и переосаждали спиртом, а затем образец растворяли в формамидном буфере.
Для однораундной in vitro транскрипции транскрипционные комплексы собирали 10 мин при 37*С, в объеме 10 мкл в составе 40 мМ трис-HCl pH 8.0, 40 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 100 нМ РНКП-сигма70 холофермента E. coli (Epicentre) и 10 нМ ДНК-матрицы. После формирования комплексов в реакцию добавляли 50 мкг/мл гепарина, 100 мкМ ATP, GTP и UTP, 10 мкМ CTP и 0.33 мкМ ?-32P-CTP (3000 мКи/ммоль). Реакции инкубировали 15 мин при 37*С для однораундного синтеза РНК и останавливали добавлением равного объема формамидного буфера для нанесения.
