Картирование активных внутренних промоторов оперона mcc
Картирование активных внутренних промоторов оперона mcc in vivo методом полнотранскриптомного секвенирования.
Чтобы выявить промоторы, активные при экспрессии генов mcc in vivo, было проведено определение стартов транскрипции методом dRNAseq [ Dugar, 2013 ].
Метод dRNAseq позволяет одновременно выявить точки старта транскрипции и охарактеризовать транскриптом образца, сравнивая результаты полного секвенирования библиотеки кДНК, построенной на РНК, обработанной ("+TEX") и не обработанной терминальной экзонуклеазой ("-TEX"). Образец "+TEX" библиотеки обогащен последовательностями начальных участков новосинтезированных транскриптов, а образец "-TEX" содержит все последовательности исходного образца РНК. Достоверными точками старта транскрипции считаются такие точки, для которых в библиотеке "+TEX" имеется ярко выраженный пик. Также желательно, чтобы покрытие библиотеке "+TEX" было выше покрытия соответствующего участка в библиотеке "-TEX". Типичная картина потенциального промотора при определении методом dRNAseq показана на Рис. 28 .
Для детекции внутренних промоторов mcc РНК выделяли из клеток, несущих плазмиду с кластером mcc, выращенных на богатой среде LB с добавлением или без добавления 0.2% глюкозы. При добавлении глюкозы основной cAMP-CAP зависимый промотор микроцинового оперона остается неактивным, что должно позволять лучше детектировать более слабые внутренние промоторы. Результаты dRNAseq анализа представлены на Рис. 29 .
При анализе библиотеки "-TEX" заметно повышение количества транскрипта mccF при добавлении глюкозы, что согласуется с данными, приведенными в разделе " РЕГУЛЯЦИЯ ЭКСПРЕССИИ И РОЛЬ ГЕНОВ ИММУННОСТИ В СИТЕЗЕ McC " ( Рис. 21 ). Также видно, что в присутствии глюкозы экспрессия генов mccABCD резко снижается, тогда как mccE продолжает экспрессироваться. Вероятно, именно наличие этого транскрипта обеспечивает устойчивость к McC растущих с добавлением глюкозы клеток, несущих кластер mcc с мутацией в mccF ( Рис. 22 ,Б).
При анализе библиотеки "+TEX" было найдено 7 возможных промоторов в прямом и 6 в обратном направлении. Большая часть найденных точек транскрипционного старта совпадала с точками старта определенными в эксперименте с определением активности GalK ,. Совокупно на основании данных dRNAseq и скрининга по активности GalK были выбраны 13 потенциальных промоторов для дальнейшей проверки активности в опытах in vitro.
