Картирование потенциальных внутренних промоторов оперона mcc in vivo
Чтобы определить положение внутренних промоторов, мы применили два подхода. Для поиска всех потенциальных промоторов кластера mcc генов исполь-зовалась плазмида pFD51 [ Beletskaya, 2000 ], содержащая беспромоторный репортерный ген галактокиназы galK . Плазмиды, содержащие тестовые фрагменты перед геном galK, трансформировали в клетки galK-штамма и полученные штаммы тестировали на наличие активности GalK .
В качестве тест-фрагментов мы использовали 10 фрагментов кластера mcc , длиной около 600 п.о. каждый и суммарно перекрывающих весь кластер. Каждый из фрагментов был протестирован в двух ориентациях. Клетки штамма HB101 трансформировали тестируемыми плазмидами и затем высевали на индикаторную среду МакКонки с добавлением 1% галактозы. Результаты представлены на Рис. 26 .
Проведенный тест демонстрирует отсутствие какой-либо промоторной ак-тивности в плазмидах, несущих фрагменты 1, 5 и 9, а также -1, -2, -6 и -8. Из клеток, содержащих остальные плазмиды, была выделена РНК и проведены реакции удлинения праймера для идентификации и картирования возможных внутренних промоторов. Таким путем было картировано четыре промотора в прямом и четыре промотора в обратном направлениях ( Рис. 27 ). Выявленные таким образом промоторы представляют собой участки, обладающие промоторной активностью in vivo, однако не все из них могут быть активны в составе полного кластера mcc.
