Определение места посадки рибосомы (тоупринт-анализ)
РНК mcc (+1/+146 относительно старта транскрипции оперона) получали путем in vitro транскрипции соответствующей ДНК матрицы, полученной ПЦР амплификацией, с набором реактивов T7 High-Yield RNA Synthesis Kit (New England Biolabs), и затем очищали на колонках RNA Clean&Concentrator (ZymoResearch). Далее 1 пкмоль очищенной РНК смешивали в общем объеме 5 мкл с 2 пкмоль 32P-меченого праймера, комплементарного 3'-области РНК, а также компонентами системы для in vitro трансляции (PURExpress In Vitro Protein Synthesis, дельтаRibosome или (дельтаaa, tRNA), New England Biolabs). Компоненты системы in vitro трансляции предынкубировали с 50 мкМ тиострептона в течение 3 мин при 37*С. После связывания рибосом с РНК-матрицей (37*С, 15 мин) проводили обратную транскрипцию при помощи обратной транскриптазы MuMLV (Invitrogen) в соответствии с рекомендациями производителя, после чего реакции доводили до объема 100 мкл ASE буфером (0.3 М NaAc, pH 5.3, 0.5% SDS, 5 мМ EDTA), дважды экстрагировали смесью кислый фенол/хлороформ (1:1), переосаждали и растворяли в 6 мкл формамидного буфера. Образцы подвергали электрофоретическому разделению в денатурирующем 5% (19:1) полиакриламидном геле, нанося рядом продукты сиквенсовой реакции, проведенной на той же ДНК-матрице при помощи набора реактивов fmol Thermo Sequenase Cycle Sequencng Kit (Affymetrix).
