Очистка РНК и дифференциальное секвенирование РНК (dRNA-seq)
Аликвоту ночной культуры клеток, несущих кластер генов mcc , разводили в 100 раз свежей средой LB с добавлением 100 мкг/мл карбенициллина и растили при 37*C в течение 4 часов до оптической плотности порядка 2.0, что соответствует переходу от экспоненциального роста к стационарному. От 0,5 до 3 мл культуры собрали центрифугированием, отбирали супернатант и хранили осадок клеток при -70*C до дальнейшего использования.
Для выделения РНК осадки клеток ресуспендировали в 30-50 мкл буфера TE (20 мМ tris-HCl pH 8.0, 1 мМ EDTA), обрабатывали лизоцимом 5 мин при 37*C (финальная концентрация 10 мг/мл), смешивали с 500 мкл реагента TRIzol (Invitrogen) и инкубировали в течение 5 мин при комнатной температуре. Затем добавляли 100 мкл хлороформа, интенсивно встряхивали и оставляли на льду на 15 минут для разделения фаз. После этого образцы центрифугировали 15 мин при 13 000 об/мин, отбирали водную фазу (около 300 мкл), смешивали с 2.5 объемами 96% спирта (750 мкл), замораживали в жидком азоте и центрифугировали 15 мин при 13000 об/мин. Осадок РНК дважды промывали 100 мкл 75% спирта и один раз 96% спирта, отбирали остатки жидкости и подсушивали на воздухе. Сухой осадок растворяли в 20-50 мкл деионизованной воды, обработанной DEPC (mQDEPC). Концентрацию определяли спектрофотометрически в разведенном в 50-100 раз образце на приборе Nanodrop 1000 (ThermoScientific).
Дифференциальное секвенирование РНК проводился в коллаборации с лабораторией Сynthia M. Sharma в университете Вюрцбурга, Германия. Для анализа РНК методом дифференциального секвенирования (dRNA-seq) [ Dugar, 2013 ] препарат тотальной клеточной РНК, выделенный, как описано выше, дополнительно обрабатывали свободной от РНКаз ДНКазой I (New England Biolabs) в соответствии с рекомендациями производителя, чтобы избавиться от остаточной ДНК в образцах РНК. Для удаления процессированных транскриптов РНК обрабатывали 5'-монофосфат-зависимой терминальной экзонуклеазой (TEX) (Epicentre), как описано ранее [ Dugar, 2013 ]. Библиотеки кДНК были приготовлены компанией vertis Biotechnology AG, Германия согласно описанному ранее протоколу [ Dugar, 2013 ], секвенирование проводилось на секвенаторе HiSeq2000. Полученные последовательности (reads, 1.8-2.4 млн для каждой библиотеки) накладывали на аннотированную последовательность плазмиды pp70 . Для визуализации данных строились графики покрытия (coverage), показывающие количество прочтений (read), приходящихся на каждый нуклеотид последовательности. Полученные данные визуализировали при помощи программы Integrated Genome Browser версии 6.5.3 (Affymetrix, http://genoviz.sourceforge.net/).
