Приготовление ультракомпетентных клеток E. coli
Для приготовления химически компетентных клеток использовался кальциевый метод. В 50 мл теплой среды SOB (2% бактотриптона, 0.5% дрожжевого экстракта, 10 мМ NaCl, 2.5 мМ KCl, 10 мМ MgCl2, 10 мМ MgSO4) инокулировали ночной культурой в соотношении 1:500. Клетки помещали на качалку и инкубировали при 18-22*C до достижения оптической плотности 0.3-0.7 (около 40 ч). После этого клетки резко охлаждали на водяной бане со льдом и далее все операции проводили на льду. Охлажденную культуру переносили в заранее охлажденные центрифужные пробирки и центрифугировали в течение 10 минут при 4*C, 3000 об/мин. Супернатант декантировали, осадок ресуспендировали в 20 мл холодного буфера TB (10 мМ HEPES pH 6.7, 15 мМ CaCl2, 55 мМ MnCl2, 250 мМ KCl) и инкубировали в течение 10 мин. Затем центрифугировали еще раз при тех же условиях. Осадки аккуратно ресуспендировали в 4 мл буфера TB и затем добавляли DMSO до 7%, разделяли на аликвоты по 50 мкл и замораживали в жидком азоте. Аликвоты клеток после замораживания хранили при -70*C.
