Проверка активности выбранных промоторов mcc in vitro
Для проверки активности потенциальных внутренних промоторов кластера mcc in vitro использовались соответствующие ПЦР фрагменты, сигма70 -холофермент РНКП E. coli и динуклеотидмонофосфат, соответствующий позициям -1+1 или +1+2 определенных in vivo точек старта. Стартовые точки полученных in vitro транскриптов картировали при помощи реакции удлинения праймера на in vitro синтезированной РНК. Из протестированных 13 промоторов шесть проявили активность in vitro (три прямых: 4377, 7091, 7854 и три обратных: R5612, R6931, R9164). Также была подтверждена активность показанного ранее in vivo промотора PmccF . Результаты картирования указанных точек старта транскрипции in vitro и последовательности промоторов показаны на Рис. 30 . Два антисенс-промотора находятся внутри mccABCDE оперона, они расположены в начале гена mccE - PR6(6931) и в начале гена mccD - PR7 (R5612). Обнаружен также дополнительный сильный промотор PR5 (R9164) в начале гена mccF , в то время как в опытах по удлинению праймера на РНК, выделенной из клеток-продуцентов детектировался единственный промотор PmccF (R9243) [А. Тихонов, неопубликованные данные].
Три активных сонаправленных с Pmcc промотора, P2 (4377), P3 (7091) и P4 (7854), обнаружены внутри оперона mccABCDE . Ни один из них не расположен непосредственно перед генами устойчивости. Промотор P4 находится близко к 3'-концу mccE и не может обеспечивать устойчивость к McC . Слабый промотор P2 находится в начале гена mccC . С РНК, инициированной с промотора P2, могла бы синтезироваться укороченная форма MccC . Возможность функционирования укороченной формы MccC в качестве экспортной помпы для McC не исключена, однако требует экспериментальной проверки. Данные dRNAseq также продемонстрировали наличие в выращенных с добавлением глюкозы клеток транскрипта mccE, иницированного с одного из двух промоторов, расположенных в начале mccE (6535 или 6361, Рис. 29 ) и укороченного транскрипта mccE, инициированного с P3.
Из перечисленных промоторов 6361 и P3 имеют близкую к консенсусу - 10 последовательность ( Рис. 30 ,Б). Тем не менее, только P3 был активен в транскрипции in vitro с сигма70-холоферментом РНКП . Возможно, для активности промоторов 6535 и 6361 требуются дополнительные транскрипционные факторы либо альтернативный сигма-фактор. С укороченного транскрипта mccE , инициированного с промоторов P3, 6535 или 6361 мог бы транслироваться укороченный вариант МccE , содержащий ацетилазный домен, которого должно быть достаточно для обеспечения иммунности к McC [ Novikova, 2010 ]. На возможную активность подобных внутренних промоторов указывают также результаты ранних опытов лаборатории Морено [ Novoa, 1986 ]. В этих экспериментах клетки, несущие плазмиды, содержащие фрагменты от 3'-конца гена mccB до 3'-конца гена mccF или от 3'-конца гена mccB до середины mccE приобретали полную или частичную устойчивость к McC . Весьма вероятно, что инициированные с расположенных в этих фрагментах внутренних промоторов транскрипты обеспечивали устойчивость клеток в McC. В клетках, несущих все гены mcc такие транскрипты могли бы обеспечивать иммунность клеток к McC на ранних стадиях роста в отсутствие активного MccF .
