Реакция удлинения праймера на РНК
Для реакции обратной транскрипции использовали от 1 до 6 мкг тотальной РНК в 10 мкл со 100 ед. обратной транскриптазы MuMLV (Invitrogen) по инструкции производителя в присутствии 1 пкмоль меченого 32P-генспецифического праймера. Вначале проводили отжиг праймера, смешивая тотальную РНК, дезокрибонуклеотидфосфаты и 32P-меченый праймер в объеме 7 мкл. Смесь денатурировали при 65*C в течение 5 мин, а затем переносили в лед на 10 мин. После этого добавляли 3 мкл смеси, содержащей обратную транскриптазу в реакционном буфере (50 мМ трисHCl, pH 8.3, 75 мМ KCl, 3 мМ MgCl2, 10 мМ DTT) и проводили реакцию удлинения праймера в течение 55 мин при 37*С. Реакцию останавливали добавлением равного объема формамидного буфера для нанесения и затем наносили на 8% денатурирующий акриламидный гель.
Для идентификации продуктов реакции удлинения праймеров проводили реакцию секвенирования (fmol DNA CycleSequencing kit, Promega) микроциновой плазмиды. В реакциях секвенирования использовали тот же меченый праймер, что и в реакциях удлинения праймера на РНК.
