Транскрипт mccA необходим для продукции микроцина C
Чтобы получить представление о транскрипции кластера генов mccABCDE , была выделена тотальная РНК из клеток E. coli, несущих плазмиду с кластером микроциновых генов mcc . Для выделения РНК клетки выращивались на богатой среде до фазы позднего экспоненциального роста, когда активируется синтез антибиотика [ Fomenko, 2001 ]. Препарат выделенной из этой культуры тотальной РНК анализировали методом дифференциального секвенирования РНК (dRNAseq), который позволяет одновременно идентифицировать точки старта транскрипции и получить данные об уровне экспрессии генов [ Dugar, 2013 ]. Метод основан на том, что первичные (насцентные) бактериальные транскрипты несут 5'-трифосфат, тогда как продукты расщепления РНК - 5'-монофосфат [ Sharma, 2010 ]. В ходе процедуры dRNAseq половина образца РНК ("- TEX ") обрабатывается ферментом TAP (кислой пирофосфатазой табака) , отщепляющей пирофосфат от 5'-трифосфата первичной РНК с образованием 5'-монофосфата. Вторая половина образца ("+ TEX ") предварительно обрабатывается 5'- монофосфатзависимой терминальной экзонуклеазой (TEX) . Этот фермент расщепляет молекулы РНК, несущие 5'-монофосфат. В результате "+TEX" образец оказывается обогащен первичными транскриптами, тогда как "-TEX" содержит все транскрипты исходного образца тотальной РНК.
Результаты dRNAseq анализа экспрессии оперона mccABCDE показаны на Рис. 11 ,А. Как можно видеть, наблюдалось значительное покрытие (coverage) в области начала кластера генов биосинтеза McC как в "+TEX", так и в "-TEX" образце. Высокое покрытие "-TEX" образца в области гена mccA, которое резко снижается сразу за этим геном, может свидетельствовать о наличии отдельного короткого транскрипта. Покрытие этой области понижено почти в 30 раз в "+TEX" образце, однако остается весьма высоким. Положение 5'-концов полученных ридов соответствует ранее опубликованным данным по положению CAP-cAMP-зависимого промотора.
Также Рис. 11 ,А демонстрирует отсутствие в опероне mcc промоторов, сравнимых по силе с основным промотором Pmcc . По всей видимости, в основном именно транскрипция с этого промотора определяет экспрессию генов mccABCDE. Тем не менее, дополнительно детектируются несколько не столь ярко выраженных точек старта транскрипции, расположенных внутри генов mccB и mccE . РНК, синтез которой может быть инициирован с этих точек, не содержит полноразмерной рамки считывания mccB и таким образом не может иметь влияния на соотношение mccA/mccB, который является предметом данного раздела. Возможное значение дополнительных точек старта транскрипции будет рассмотрено в разделе " Внутренние промоторы оперона mcc .
Для проверки гипотезы о существовании отдельного транскрипта, содержащего mccA, была проведена Нозерн-блот гибридизация с использованием меченого олигонуклеотида (зонда), комплементарного открытой рамке считывания mccA . На Рис. 11 ,Б видно присутствие короткого транскрипта длиной около 100 нт в клетках, несущих плазмиду pp70 , содержащую кластер генов mcc , и синтезирующих McC . Указанный транскрипт не детектируется в клетках, не несущих данную плазмиду ( Рис. 11 ,Б, ср. дорожки 1 и 2). Также короткий транскрипт не удалось детектировать в клетках, несущих плазмиду c делецией инвертированного повтора в межгенном участке mccA-mccB ( Рис. 11 ,В, слева, верхняя панель). При этом количества продуктов контрольного плазмидного гена ампициллиновой устойчивости bla и гена mccB, как видно из эксперимента по удлинению соответствующих комплементарных РНК-матрице праймеров ( Рис. 11 ,В, слева, ср. дорожки 1 и 2), остались неизменными после делеции в межгенном участке.
5'- и 3'-концы mccA транскрипта определялись при помощи процедуры быстрой амплификации концов кДНК (RACE). 5'-конец транскрипта расположен на 29 нт выше ATG кодона mccA, что совпадает с ранее опубликованными данными [ Moreno, 2002 ] и данными dRNAseq. 3'-конец mccA удалось определить с точностью до трех нуклеотидов. Конец транскрипта совпадает с тремя последовательными аденинами, расположенными сразу за потенциальной терминаторной шпилькой. Таким образом, точный размер короткого транскрипта mccA составляет 105-107 нт, транскрипт содержит целиком открытую рамку считывания mccA и 52-54-нуклеотидную 3'- нетранслируемую область.
Полуколичественный анализ с использованием в качестве маркеров in vitro транскрибированных моно- и полицистронного транскриптов mcc оперона показал, что на каждый полицистронный транскрипт приходится около 20 молекул моноцистронного транскрипта. В то же время клетки, несущие плазмиду с mcc опероном, в котором делетирован участок, содержащий предположительный терминатор, синтезируют в 30 раз меньше McC, чем клетки, несущие интактный кластер mcc ( Рис. 11 ,В, справа). Поскольку уровень транскрипта гена mccB при введении делеции в межгенный участок не меняется, можно предположить, что для эффективного синтеза McC необходимо наличие моноцистронного транскрипта mccA, вероятно, позволяющего синтезировать достаточные количества структурного пептида MccA, который затем конвертируется в McC ферментом MccB.
