Энзиматическое определение структуры РНК (пробинг)
РНК, cинтезированную in vitro, как описано выше, подвергали дефосфорилированию при помощи щелочной фосфатазы теленка (CIAP, Fermentas), а затем радиоактивно метили по 5'-концу при помощи T4-полинуклеотид киназы (T4-PNK, Fermentas). Финальный объем реакций составлял 10 мкл. 0.2 пкмоль меченой РНК в структурном буфере (40 мМ HEPES pH 8.0, 100 мМ NH4Cl, 4 мМ DTT) денатурировали в течение 5 мин при 95*С и охлаждали во льду 5 мин. К РНК добавляли MgCl2 до 10 мМ и оставляли для медленного сворачивания на 10 мин при 37*С, после чего добавляли 1 мкг дрожжевой тРНК. Для пробинга к реакциям добавляли 1 мкл РНКазы T1 или T2 (0.01 ед/мкл, Boehringher-Mannheim) и оставляли для расщепления еще на 5 мин при 37*С. Реакцию останавливали, добавляя равным объем формамидного буфера для нанесения на полиакриламидный гель.
В случае, когда определяли структуру комплекса РНК-рибосома, после денатурации вместо хлорида магния добавляли компоненты системы in vitro трансляции (PURExpress In Vitro Protein Synthesis Kit), предынкубированные с тиострептоном (50 мкМ). В этом случае после окончания обработки РНКазами реакции останавливали добавлением ASE буфера (0.3 М NaAc, pH5.3, 0.5% SDS, 5 мМ EDTA) до объема 100 мкл, дважды экстрагировали смесью кислый фенол/хлороформ (1:1) и переосаждали, после чего растворяли в формамидном буфере для нанесения.
Маркер длин фрагментов получали, денатурируя 0.2 пкмоль меченой РНК в сиквенсовом буфере (20 мМ цитрат pH 5, 1 мМ EDTA, 7 М мочевина) в течение 5 мин при 95*С, и обрабатывая 1.5 мкл РНказы Т1 (0.01 ед./мкл)при 37*С в течение 10 мин. Реакцию останавливали добавлением равного объема формамидного буфера.
