Методы специфического расщепления ДНК
Необходимость разработки методов специфического расщепления геномной ДНК на фрагменты, длина которых больше той, которая получается при использовании "обычных" ферментов, встала достаточно давно. Еще в 1984 г. McClelland с соавт. предложил метод специфического расщепления ДНК по сайтам длиной 8 и 10 нуклеотидов [ McClelland M. e. a., 1984 ]. Они воспользовались тем, что рестриктаза DpnI расщепляет ДНК по последовательности GmATC только в том случае, если метилированы остатки аденина в обеих цепях. Следовательно, если обработать ДНК метилазой TaqI (TCGATCGmA) или ClaI (ATCGATATCGmAT), то DpnI будет расщеплять ДНК только в последовательностях
5'TCGmA TCGmA3' и 5'A TCGmA TCATCGmAT3'
3'mAGCTmAGC T5' 3'TmAGC TmAGTAGC TA5'
Однако такие методы достаточно трудоемки, поэтому не получили большого распространения.
Наиболее быстрым и удобным методом получения крупных фрагментов ДНК остается использование редкощепящих рестриктаз. С их помощью при применении PFGE удается строить достаточно протяженные карты хромосомных областей. При этом такое картирование имеет свои особенности. Главной является то, что визуализация интересующих фрагментов ДНК возможна только путем гибридизации, следовательно, обязательным условием является наличие зонда, расположенного поблизости от картируемого района. Это несколько ограничивает применение данного метода, но необходимо учитывать тот факт, что с помощью PFGE можно картировать районы протяженностью до 9 Мб, что составляет 7% длины средней хромосомы. Более надежно, конечно, ориентироваться на меньшие расстояния (около 1 Мб), но и в этом случае для получения рестриктной карты хромосомы длиной 130 Мб достаточно 130 маркеров. Кстати, использование редкощепящих рестриктаз значительно облегчает получение таких наборов маркеров.
