Электрофорез в пульсирующем поле PFGE
Метод электрофореза в пульсирующем поле (Pulsed Field Gel Electrophoresis, PFGE) впервые был описан D.C. Schwartz с соавт. в 1982 г. [ Schwartz D.C., e. a., 1984 ]. Он позволяет проводить разделение фрагментов ДНК практически любого размера. Суть его заключается в том, что молекулы ДНК мигрируют в геле под воздействием периодически меняющегося по направлению электрического поля. Несмотря на то, что существуют и широко используются несколько модификаций этого метода, до сих пор не существует количественной физической модели разделения молекул ДНК в пульсирующем поле. Первоначально D.C.Schwartz и C.L.Cantor объяснили эффект разделения тем, что время переориентации молекул ДНК разного размера в меняющемся поле различно [ Schwartz D.C. e. a., 1984 ].
Позднее E.M.Southern с соавт. предложили модель, лучше согласующуюся с экспериментальными данными [ Southern E.M. e. a., 1987 ]. Они исходили из того, что при движении в электрическом поле молекула ДНК принимает вытянутую вдоль поля конформацию. При этом передний конец молекулы движентся только вдоль поля и не может пересечь тот путь, по которому молекула движется за ним (если допустить, что это возможно, придется предположить, что часть молекулы движется в направлении, противоположном приложенному электрическому полю). Таким образом, ни один сегмент молекулы не пересекает другой и ее общая длина пропорциональна размеру.
При обычном электрофорезе молекулы ДНК больше определенного размера движутся с равной скоростью. Логично предположить, что их передние концы входят в гель и движутся на одном уровне. Вытянутая конформация молекул сохраняется и после выключения тока, поскольку скорость диффузии молекул ДНК в геле невелика (что подтверждается тем, что полосы ДНК размером несколько килобаз остаются в геле достаточно узкими в течении нескольких дней после разделения).
При смене направления электрического поля молекулы ДНК могут двигаться в новом направлении только вслед за одним из концов молекулы, или формируя новый "конец", перегибаясь где-то в середине. Последний вариант требует совершения большей работы и происходит, вероятно, реже, чем движение вперед одним из физических концов молекулы.
Если новое поле приложено под углом 90, то лидирующим может стать любой конец молекулы, если меньше 90 - то бывший "передний" конец, если больше 90 - то бывший "задний" конец. Таким образом, разделение будет происходить в том случае, если угол смены направления электрического поля больше 90. Степень разделения молекул будет пропорциональна их длине и количеству "пульсов" (изменений поля), до определенного предела степень разделения не будет зависеть от продолжительности пульса. Эти и другие выводы модели подтверждаются экспериментальными данными.
В настоящее время существует несколько модификаций данного метода. Наиболее часто используются FIGE и CHEF .
Использование пульс-фореза в сочетании с применением редкощепящих рестриктаз позволило в 1987 г. получить первую карту генома штамма К12 E. coli, а в 1989 г. первую полную рестриктную карту генома эукариотического организма (дрожжей Saccharomyces pombe, размер генома 15 Мб) [ Smits C.L. e. a., 1990 ].
Метод картирования с помощью PFGE стал за последние годы стандартным, поэтому проанализировать все работы, проведенные с его использованием, не представляется возможным. В качестве примера ниже приведены некоторые из последних работ в этой области.
Так, например, в 1992 г. группа японских и американских ученых сообщила о создании рестриктной карты протяженных участков хромосомы 21 человека [ Ichikawa H. e. a., 1992 , Wang D. e. a., 1992 ]. В первой работе ([ Ichikawa H. e. a., 1992 ]) был применен оригинальный метод построения рестриктной карты - использовалась геномная ДНК гибридных клеток человек-хомяк, которые содержали только 21ю хромосому из человеческих хромосом. Эту ДНК рестрицировали NotI, разделяли с помощью пульс-фореза. Человеческие NotI фрагменты идентифицировали гибридизацией с человек-специфичным Alu-зондом. Соседние клоны определяли гибридизацией с NotI-связующими клонами (см. ниже). Таким образом авторам удалось избежать проблем, связанных с неоднозначностью результатов разделения с помощью PFGE, происходящих от изменений в подвижности фрагментов ДНК от геля к гелю. Была сконструирована непрерывная карта с 6 NotI-связующими клонами, покрывающая более 20 Мб проксимальной части длинного плеча хромосомы 21. Более детальное картирование позволило идентифицировать 11 потенциальных CpG-островков, указывающих на возможные места локализации генов. Во второй работе ([ Wang D. e. a., 1992 ]) сообщается о создании подробной NotI-рестриктной карты полосы q22.3 хромосомы 21. Карта протяженностью 10 Мб была сконструирована при помощи использования сразу 3 стратегий - NotI-связующих клонов для идентификации соседних фрагментов, частичной рестрикции, и полиморфизма клеточных линий для доказательства идентичности или соседства отдельных фрагментов. 29 уникальных зондов и 5 NotI-связующих клонов потребовались для определения порядка расположения 30 NotI-фрагментов. Авторы отмечают, что тот факт, что NotI-сайты встречаются в этом районе чаще, чем обычно, может указывать на повышенную плотность генов. Сравнение генетической и физической карт позволило сделать вывод о том, что рекомбинации в этом районе происходят в 10 раз чаще обычного.
Картирование геномной ДНК с помощью пульс-фореза позволяет исследовать районы, которые очень трудно исследовать другими методами. В 1991 г. R. Wevrick и H.F. Willard удалось сконструировать крупномасштабную карту района центромеры 7й хромосомы [ Wevrick R., e. a., 1990 ]. Карта построена вокруг альфоидной ДНК, которая, как известно, находится в центромере каждой хромосомы, формируя повторы длиной от сотен до тысяч килобаз. Ранее в этом районе было картировано два зонда (D7Z1 и D7Z2). Подробные карты, захватывающие один или два локуса, показали, что повторы, образуемые этими двумя маркерами не перекрываются, а сосуществуют на общем MluI фрагменте длиной от 3,5 до 5,5 Мб (в хромосомах, полученных от двух разных индивидуумов длина этого фрагмента различна). Ряд методических приемов, примененных авторами может оказаться полезными для исследования центромер других хромосом.
Другим примером работы такого рода может служить работа J.R. Ward с соавт. [ Ward J.R.T. e. a., 1993 ]. Им удалось получить рестриктную карту, перекрывающую ген APC (adenomatous polyposis coli). Это заболевание представляет собой генетическое нарушение, наследуемое как доминантный аутосомный признак. Оно характеризуется развитием множественных полипов в течении первых 20-30 лет жизни. Выделяют два фенотипа: "обильный" и "редкий". Если заболевание оставить без лечения, то существует высокая вероятность развития аденокарциномы к 40 годам. Таким образом, APC является прекрасным объектом для изучения генетически обусловленного канцерогенеза. Карта включает 35 генетических маркеров и состоит из 2 сегментов (10 и 2,5 Мб).
Интересные результаты были получены также, например, D. Vetrie с соавт. [ Vetrie D. e. a., 1993 ]. Они изучали локус XLA (X-linked agammoglobulinaemia), наследственное заболевание, характеризующееся отсутствием B-лимфоцитов в крови человека. Ген, ответственный за это заболевание, еще не идентифицирован, но известно, что он тесно сцеплен с маркером DXS178, который картирован в Xq22. В этом же районе находится ген, отвечающий за болезнь Фабри (Fabry), наследственное заболевание, вызываемое отсутствием альфа-галактозидазы А (GLA), одного из ферментов лизосом. С помощью пульс-фореза была построена рестриктная карта этого района, которая показала, что GLA и XLA находятся на расстоянии, не превышающем 140 кб, и что между ними находится несколько потенциальных CpG-островков , что указывает на возможное наличие экспресирующихся генов.
В последнее время рестриктное картирование само по себе применяется относительно редко, обычно оно используется в сочетании с клонированием протяженных участков геномной ДНК в искусственных хромосомах дрожжей. При этом изучение клонированных фрагментов используется для подтверждения и уточнения результатов анализа геномной ДНК. Например, эта же группа сконструировала карту проксимальной части полосы Xq22 протяженностью 5,2 Мб [ Vetrie D. e. a., 1993 ]. При этом на первом этапе авторы попытались установить порядок расположения 11 полиморфных и неполиморфных маркеров. В результате были получены 3 рестриктных карты вокруг групп физически сцепленных маркеров, которые покрывали около 5 Мб геномной ДНК. Затем YAC клоны из этого района были использованы для объединения полученных карт в одну, покрывающую около 5,2 Мб. Кроме того, анализ полученных результатов позволил прийти к выводу, что этот район X-хромосомы может быть богат генами.
Другим примером такой работы может служить работа C. Wijmenga с соавт. [ Wijmenga C. e. a., 1993 ]. Авторы изучали район 4й хромосомы, содержащий ген FSHD (facioscapulohumeral muscular dystrophy). FSHD является аутосомным доминантным геном, определяющим нервно-мышечное расстройство. Интересно то, что оно часто вызывается мутациями, возникающими de novo у больных. Ранее в данном районе было откартировано 4 локуса (D4S163, D4S139, D4F35S1, D4F104S1). По данным генетического картирования район, покрываемый этими маркерами, занимал около 5 сМ. Физическое картирование с помощью пульс-фореза показало, что эти локусы покрывают около 1 Мб. Для нескольких из этих локусов были получены STS и с их помощью были идентифицированы 4 YAC клона, которые подтвердили данные картирования с помощью пульс-фореза.
Другим следствием открытия редкощепящих рестриктаз стало значительное облегчение создания "прыгающих" и "связывающих" библиотек клонов.
Рестриктное картирование было одним из первых способов получения и упорядочения маркеров при исследовании геномов.
Далее см. CG - островки
