Методика внесения разрывов в основания петель ДНК топоизомеразой II
Экстракция ядер 2 М раствором NaCl позволяет удалить всю растворимую топоизомеразу II, тогда как топоизомераза II ядерного матрикса останется в составг скелетных структур нуклеоидов. Нами был разработан экспериментальный протокол для внесения разрывов в основания петель ДНК [ Banks ea 1994 , Rowe ea 1986 , Reitman ea 1990 , Udvardy ea 1991 , Razin ea 1991 , Razin ea 1993 , Gromova ea 1995 ] Заключенные в агарозные блоки клетки пермеабилизовали посредством обработки неионным детергентом и экстрагировали 2 М раствором NaCl, после чего переводили их в реакционный буфер для расщепления ДНК- топоизомеразой II. Б этом буфере препараты инкубировали в течение различных временных интервалов в присутствие BM-26 (наиболее эффективного из известных ингибиторов топоизомеразы II ). По окончании инкубации агарозные блоки с клетками помещали в раствор, содержащий додецилсульфат натрия и протеиназу К, и переваривали белки в течение 36 ч при 50*С. Свободную от белков ДНК разголяли посредством электрофореза в пульсирущем поле , после чего переносили на нейлоновые фильтры и гибридизовали с представляющими интерес пробами. Данная процедура была использована для анализа специфичности организации в петли кластера рибосомных генов китайского хомячка и человека. Было показано, что обработка интерфазных и метафазных нуклеоидов ингибиторами топоизомеразы II приводит к выщеплению из генома высокомолекулярных фрагментов ДНК, размер которых зависит в известных пределах от концентрации ингибитора и времени инкубации [ Razin ea 1991 , Opstelten ea 1989 ]. При высоких концентрациях ингибитора большая часть геномной ДНК расщеплялась до фрагментов размером 50-150 т.п.н. Как сказано выше, такие же размеры имеют петли хромосомной ДНК. Специфичность крупномасштабной фрагментации геномной ДНК топоизомеразой II ядерного матрикса анализировали после переноса фрагментов на нейлоновые фильтры и гибридизации с радиоактивной пробой, представляющей часть гена 18S рибосомной РНК. При исчерпывающем расщеплении геномной ДНК топоизомеразой II ядерного матрикса весь гибридизующийся материал выявлялся в полосе, соответствующей размеру повтора рибосомной РНК в клетках китайского хомячка (около 37 т.п.н.). При более низких концентрациях ингибитора гибридизующийся материал распределялся между набором фрагментов с размером, кратным размеру повтора рибосомной ДНК. Полученные результаты позволили предположить, что каждый повтор рибосомной ДНК организован в индивидуальную петлю. Участок расщепления рибосомной ДНК топоизомеразой II ядерного мприкса был локализован в нетранскрибируемом спейсере непосредстзенно перед началом транскрипционной единицы. Очевидно, что при исчерпывающем расщепленни геномной ДНК топоизомеразой II разрывы вносятся в основания всех петель, тогда как при недостаточных концентрациях ингибитора атакуется лишь часть оснований петель, в силу чего вырезаются как индивидуальные петли, так и их олигомеры. Итак, опыты с рибосомными генами показали, что разработанный нами экспериментальный протокол может быть использован для картирования границ петель хромосомной ДНК. В дальнейшем этот протокол был применен для построения карт организации в петли других областей генома эукариот [ larovaia ea 1996 , Razin ea 1993 , Gromova ea 1995 ]. В этих опытах вслед за вырезанием петель ДНК топоизомеразой II ядерного матрикса картировали положение концов индивидуальных петель относительно участков расщепления ДНК редкощепящми рестриктазами (такими, как Not l и SiI ). Для этого применили хорошо известный метод непрямого мечения концов рестриктазных фрхгментов, но вместо обычного агарозного электрофореза использовали электрофорез в пульсирующем поле. Понятно, что картировать границы петель можно было лишь относительно участков расщепления ДНК редкощепящими рестриктазами. В дальнейших экспериментах бьыш построены карты организации в петли амплифицированного локуса гена c-MYC человека [ Gromova ea 1995 ] и протяженной (4500 т.п.н.) области Х-хромосомы генома Drosophila melanogaster [ larovaia ea 1996 ].
Результаты этой работы позволили сделать несколько заключений общего характера. Прежде всего, стало ясно, что вырезание петель хромосомной ДНК топоизомеразой II ядерного матрикса может быть использовано при картировании границ петель ДНК в любой области генсма. Фактически, можно говорить о том, что разработана экспериментальная процедура, позволяющая создавать принципиально новые физические карты протяженных районов генома. В отличие от лишенных биологического смысла карт, показывающих положение участков расщепления ДНК рестриктазами, карты нового типа будут отражать внутренний принцип организации генома в структурные домены (закрепленные на хромосомном остове петли ДНК), поэтому эти карты могут оказаться более полезными для различных функциональных исследований.
Вторым важным результатом опытов по картированию границ петель ДНК в различных участках генома явилась демонстрация того, что последовательность ДНК, обеспечивающая закрепление петли на ядерном матриксе, является достаточно протяженной (несколько тысяч пар нуклеотидов. Комплексные взаимодействия различных участков этой последовательности с белками ядерного матрикса обеспечивают устойчивость всей структуры к экстракции концентрированными солевыми растворами. Наконец, было показано, что определенная часть картируемых по связыванию с ядерным матриксом in vitro MAR/SAR-элементов локализуется в участках закрепления петель ДНК на ядерном матриксе [ larovaia ea 1996 ]. В то же время большая часть MAR/SAR-элементов находится в петлях ДНК.
Таким образом, они скорее всего представляют собой потенциальные участки прикрепления ДНК к матриксу. Для закрепления петель ДНК на ядерном матриксе MAR/SAR-элементы должны работать в кооперации с некими другими последовательностями, например, с участками связывания ряда специфических белковых факторов и с простыми последовательностями, которые были идентифицированы в опытах по клонированию коротких фрагментов ДНК ядерного матрикса.
