ПЕТЛИ ДНК: ВЫРЕЗАНИЕ ДНК-ТОПОИЗОМЕРАЗОЙ II ИЗ ЯДЕРНОГО МАТРИКСА
Петли ДНК: вырезание топоизомеразой II ядерного матрикса: введение
Методика внесения разрывов в основания петель ДНК топоизомеразой II
Взаимодействие хроматина с матриксом достаточно устойчиво и не нарушается при экстракции с помощью растворов с высокой ионной силой. Это дает возможность выделять фрагменты ДНК, расположенные в основаниях петель. Для их изоляции надо внести двухцепочечные разрывы (с помощью исчерпывающего расщепления неспецифическими нуклеазами или рестриктазами) в препарат ядер, затем провести экстракцию в растворе с высокой или средней концентрацией соли, и отделить связанные с нуклеоскелетом фрагменты ДНК несколькими промывками солевым раствором высокой концентрации ( Berezney R. and Coffey D.S., 1974 ). Так может быть получена ямДНК ( nmDNA -nuclear matrix DNA) ( Razin S.V. and Vassetzky Y.S., 1992 ). Различные варианты метода обусловлены тем, что разные авторы используют различные соли для экстракции и концентрации солей для преэкстракции ядер, а также различные расщепляющие ДНК ферменты.
После изоляции ямДНК должны были быть поставлены два связанных между собой вопроса:
1. Имеют ли концы петель специфическое расположение в геноме?
2. Специфические ли последовательности локализованы в основаниях петель ДНК?
Рассмотрим теперь результаты экспериментов по изучению взаимодействия ДНК с матриксом, в которых использовался метод высокосолевой экстракции матрикса. В экспериментах по ренатурации ямДНК было показано, что она достаточно обогащена повторяющимися последовательностями ( Hancock R. and Huges M.E., 1982 ). В дальнейшем это было подтверждено некоторыми авторами, в то время, как другие не отмечали какой-либо специфичности ямДНК ( Basler J. ea, 1981 ). Нужно отметить, что даже там, где показывалось обогащение ямДНК повторами, эта фракция ДНК содержала достаточное количество уникальных последовательностей, а спектр повторов, которые в ней присутствовали, был достаточно широк.
Более значимые результаты были получены в ходе экспериментов, ставящих своей целью показать положение генов внутри петель ДНК. В большинстве опубликованных работ обсуждалась корреляция между транскрипционным статусом гена и его взаимодействием с матриксом. Активные гены в основном находились вблизи ямДНК, а неактивные - в отмываемой фракции ( Cook P.R. and Brazell I.A., 1980 ; Razin S.V., 1987 ). В экспериментах по изучению гормонально-индуцированной дифференцировки клеток, гены, которые начинали экспрессироваться в дифференцированных клетках, были ассоциированы с матриксом в этих клетках и неассоциированы в недифференцированных клетках. Также отмечалась позитивная корреляция между экспрессией вирусных, интегрированных в клеточный, геномов и их взаимодействием с матриксом этих клеток ( Cook P.R. ea, 1982 ). В ходе картирования достаточно больших регионов ДНК различных эукариот также была отмечена связь между взаимодействием ДНК с ядерным матриксом и ее транскрипцией.
Все эти результаты были достаточно трудно объяснимы, если принять начальную модель, основывающуюся на корреляции петлевой организации ДНК и доменной организацией генома. Все специфические взаимодействия хроматина с ядерным матриксом казались зависимыми только от различных функциональных процессов, которые различны в клетках различных линий, но такая новая модель петлевой организации ДНК, базирующаяся на ее функционально- зависимом взаимодействии с матриксом, не могла объяснить всех экспериментальных данных, например корреляции размера петель ДНК с размером репликонов в клетках различных видов ( Buongiorno-Nardelli M. ea, 1982 ). В связи с этим была предложена новая модель петлевой организации хроматина .
Далее см. Хроматин: модель петлевой организации .
