Петли ДНК: вырезание ДНК-топоизомеразой II ядерного матрикса: введение
Подводя итог предыдущей дискуссии, можно отметить, что за 20 лет, прошедших с того времени, когда вопрос о специфичности организации хромосомной ДНК в петли был впервые четко сформулирован, однозначного ответа на этот вопрос так и не было получено. В этой связи актуальной оставалась задача разработки надежного способа картирования границ петель хромосомной ДНК в протяженных областях генома. Во всех предыдущих исследованиях ключевым этапом экспериментов, направленных на решение вопроса о специфичности организации ДНК в петли, являлось выделение прикрепленной к ядерному матриксу фракции ДНК, которую отождествляли с основаниями петель. Мы решили подойти к этому вопросу с принципиально иных позиций и сосредоточить усилия на характеристике индивидуальных петель после вырезания их из генома. Можно сказать, что сама природа снабдила экспериментаторов инструментом, позволяющим разрезать геном по границам закрепленных на ядерном матриксе петель ДНК. Было показано, что одним из белков ядерного матрикса является ДНК- топоизомераза II . Известно, что в ходе катализируемых топоизомеразой II реакций релаксации и декатенации ДНК в молекулу ДНК вносится двунитевой разрыв [ Liu ea 1985 , Wang ea 1985 ]. При этом концы ДНК удерживаются вместе посредством контакта между двумя субъединицами топоизомеразы II ( рис. 2 ). Такой промежуточный комплекс существует очень недолго. После лигирования концов ДНК топоизомераза освобождается. Однако существует целый ряд ингибиторов топоизомеразы II (таких, например, как эпиподофилотоксины ), блокирующих катализируемую топоизомеразой реакцию на стадии образования промежуточного комплекса фермента с ДНК Обработка накопленных промежуточных комплексов додецилсульфатом натрия с последующим перевариванием белков протеиназой К приводит к появлению разрыва на месте осуществления топоизомеразной реакции. Мы показали, что топоизомераза II ядерного матрикса находится в непосредственном контакте с ДНК и сохраняет свою активность после экстракции ядер концентрированным солевым раствором [ Vassetzky ea 1989 ]. Таким образом, представлялось вполне возможным использовать реакцию расщепления ДНК топоизомеразой II для внесения разрывов в основания закрепленных на ядерном матриксе петель ДНК, как показано схематически на рис. 2 . Хорошо известно, что топоизомераза II находится не только в ядерном матриксе, но и в нуклеоплазме [ Banks ea 1994 ]. В ряде работ было показано, что этот растворимый фермент способен расщеплять ДНК в любых доступных местах, в том числе в участках гиперчувствительности к ДНКазе I и даже в межнуклеосомных спейсерах [ Rowe ea 1986 , Reitman ea 1990 , Udvardy ea 1991 ].
