Rad50 Pyrococcus furiosis (pf) в DSBR: исследование функции и структуры
Rad50 Pyrococcus furiosis (pf) образует комплекс с pfMre11 со свойствами, подобными таковым как Rad50/Mre11 человека, так и SbcC/SbcD E.coli ( Hopfner и др., в печати ). Для исследования биохимии Rad50, а также для проверки того, образуют ли N- и C-концевые сегменты упомянутых последовательностей ATP-связывающих доменов функциональный домен, мы совместно экспрессировали аминокислотные остатки pfRad50 с 1- го по 152-й (Сегмент N) и с 735-го по 882-й (Сегмент C) и изучили их сборку и взаимодействия с ATP и ДНК ( Рисунок 1 ). На всех стадиях очистки сегмент N и сегмент C, очищенные как единый комплекс, определялись как каталитический домен Rad50 ( Rad50cd ). Установленный с помощью центрифугирования и гель-фильтрационной хроматографии молекулярный вес 35 кДа (данные не приведены) соответствует предсказанному молекулярному весу Rad50cd в 35 кДа. Эти результаты, а также электронная микрография SbcC/SbcD ( Connelly и др., 1998 ) и белков SMC ( Melby и др., 1998 ) поддерживают представление о сборке двух антипараллельных полипептидов Rad50, приводящей к возникновению двух "головок" Rad50cd, соединенных суперспиралью, причем эта структура подобна двуглавому змию ( Рис 2A ).
Для установления того, обладает ли Rad50 ферментативной активностью, мы измерили степень гидролиза ATP Rad50cd и полноразмерным комплексом pfRad50/pfMre11. Как Rad50cd, так и комплекс pfRad50/pfMre11 расщепляют ATP очень медленно, предполагая наличие у Rad50 скорее функции переключателя, нежели функции двигательной или хеликазной. Комплекс pfRad50/pfMre11 лишь вдвое эффективнее Rad50cd ( Рис 1A ), подтверждая, что Rad50cd - внутренний каталитический домен. Гидролиз соответствует диапазону от 0,01 до 0,65 ммоль ATP/мин/мг, обозначенного для NBD ABC-переносчиков ( Holland и Blight, 1999 ) и, таким образом, соотносится с общим механизмом действия АBC-ATPаз при DSBR и мембранном транспорте ( Aravind и др., 1999 ).
