Характеристики взаимодействия TRADD с TRAF2 методом ППР
Характеристики взаимодействия природной и мутантной форм TRADD с TRAF2 с использованием биосенсорных измерений показали, что эта новая форма взаимодействий TRADD-TRAF2 предполагает существенно более высокие сродство и специфичность по сравнению с взаимодействиями TRAF2 и рецептора.
Для характеристики сродства и энергетических детерминантов взаимодействия TRADD-TRAF2 были использованы биосенсорные анализы плазмонного поверхностного резонанса , произведенных для нативной и мутантной форм TRADD-N ( Рисунок 3 ). Во избежание потенциальных эффектов нежелательного сродства тримерный TRAF- домен TRAF2 был соединен с биосенсорным чипом для измерения степени связывания мономерного TRADD-N. Это взаимодействие давало константу диссоциации 7,8 #+- 3,6 мМ с частотой ассоциации 1,65 +- 0,7 х 10 (5) М(- 1)s(-1) и частотой диссоциации 1,3 +- 0,2 s(-1). Это взаимодействие существенно сильнее непосредственных взаимодействий рецептора и TRAF2 (Kd = 40 mM - 1,0 mM) ( Ye и Wu, 2000 ). Однако, пока это плохо сопоставимо с другими белок-белковыми взаимодействиями ( Kuriyan и Cowburn, 1997 ), являющимися показателями важности мультимерного взаимодействия при воздействии TRAF2 и сборке сигнального комплекса TNFR1. Важность удельного сродства в дальнейшем подтверждается существенным увеличением аффинности при связывании тримерного TRAF2 с биосенсорными микросхемами в совокупности с возрастанием плотностей TRADD-N.
Остатки в областях I и II оказывают различное влияние на сродство связывания, не имеющее отношения к внутренней области связывающей поверхности взаимодействия ( Рис 3 ). В целом замещения аланином остатков области I (Y16, F18, H65 и S67) имеют более выраженные последствия, несмотря на меньший вклад остатков аланина в увеличение площади поверхности. Это может объясняться недоступностью комплекса для растворителя и большей гидрофобностью контакта. Остатки области II были выбраны из-за большей площади их поверхности, а также их способности к образованию прямых и опосредованных молекулами воды водородных связей или солевых мостиков поверхности взаимодействия (Q143, D145, R146, L147). Весьма неожиданным оказалось то, что мутации Q143, D145 и L147 возымели минимальное влияние на энергию связывания (не более, чем в 3 раза). Единственный оказывающий значительное влияние остаток - R146, образующий скрытые двойные водородные связи и солевой мостик с остатком D445 TRAF2. Для большинства мутаций областей I и II непосредственное удаление определенного взаимодействия приводит к возникновению большего эффекта по сравнению с локальными нарушениями конформации. Это подкрепляется аддитивной природой дельта-дельта-G мутантных TRADD-N и дельта-дельта-G мутантных TRAF2 по сравнению с измеренными значениями дельта-дельта-G между мутантными белками TRADD-N и TRAF2 (данные не приведены).
Следовательно, оказывается, что область I является преимущественно энергетической определяющей взаимодействия, тогда как вклад области II существенно ниже, вероятно, ввиду подвижности, обеспечиваемой за счет опосредуемых молекулами воды взаимодействий. С другой стороны, электростатическая природа области II может обеспечивать дистанционные силы притяжения для укрепления взаимодействия.
Обменный мутагенез показывает специфичность TRADD для TRAF1 и TRAF2: для вовлечения cIAP в сигнальный комплекс.
