Альфа-сателлиты локуса alpha13-II/21-II
Первыми клонированными последовательностями альфа-сателлитной ДНК, локализованными на хромосомах 13 и 21 и отличающимися от последовательностей локуса alpha21-I, стали клон pTRA-1 , клон pTRA-2 , клон pTRA-4 и клон pTRA-7 [ Vissel, Choo, 1992 ]. Все они локализовались на хромосомах 13, 14 и 21 и не имели ПЕВП.
Авторы предположили, что эти альфа-сателлитные последовательности организованы в виде отдельных "микродоменов". Также был выделен и охарактеризован клон pTR9 , содержащий альфа-сателлитные повторы и сателлит III [ Vissel et al., 1992 ]. Сателлитные домены в клоне pTR9 разделены двумя копиями короткого (9 н. п.) прямого повтора. Позже было показано, что все эти последовательности относятся к надхромосомным семействам 4 и 5 [ Alexandrov et al., 1993b ; Romanova et al., 1996 ]. Картирование этих клонированных последовательностей, а также последовательностей локуса alpha21-I, методом электрофореза в пульсирующем поле с использованием набора различных эндонуклеаз рестрикции позволило установить относительное расположение и размер альфа-сателлитных доменов в прицентромерных районах хромосом 13, 14 и 21 [ Trowell et al., 1993 ] ( рис 4 каз ). По этим оценкам, размер "микродоменов", соответствующих клонам pTRA-1, pTRA-2, pTRA-4 и pTRA-7, составляет менее 50 т. н. п. Следует критически относится к этим данным, так как размер "микродоменов" меньше, чем позволяет определить метод электрофореза в пульсирующем поле. Это, в сочетании с отсутствием ПЕВП, позволяет сделать вывод, что фактически данные клоны, по-видимому, являются однокопийными. Впервые наличие крупного альфа-сателлитного домена, содержащего последовательности, отличающиеся от альфа- сателлитных повторов локуса alpha13-I/21-I, было показано в работе Ikeno et al. (1994) . Он был идентифицирован при помощи ПЦР с праймерами, специфичными для альфа-сателлитов хромосомы Y. В качестве ДНК-матрицы для ПЦР использовали ДНК соматического клеточного гибрида WAV17, несущего хромосому 21 человека. Авторы дали этому домену название alpha21-II и клонировали пять последовательностей из этого локуса ( клон pN21 , клон pN23 , клон pN24 , клон pN31 , клон pN32 ). Все эти последовательности не имеют ПЕВП, не содержат участки связывания CENP-B и не гибридизуются с последовательностями из локуса alpha21-I в условиях высокой жесткости. Клон pN24 содержит фрагмент дисперсного ДНК повтора L1 . Гомология между отдельными мономерами этих последовательностей составляет 71-89%, а гомология с альфа-сателлитными повторами локуса alpha21-I - 53-81%. Анализ связывания CENP-B с последовательностями локусов alpha21-I и alpha21-II показал, что в последовательностях локуса alpha21-I участки связывания CENP-B встречаются в каждом втором мономере, а в последовательностях локуса alpha21-II - один на 100 мономеров.
Локус alpha21-II картирован при помощи FISH в проксимальной части короткого плеча хромосомы 21 (в отличие от локуса alpha21-I, картированного в области первичной перетяжки). Авторам не удалось точно определить размер домена, соответствующего локусу alpha21-II, из-за сильного метилирования этого района хромосомы 21 в клетках соматического гибрида WAV17. Они пришли к выводу, что в прицентромерном районе хромосомы 21 расположены два крупных альфа-сателлитных домена: alpha21-I, имеющий регулярную структуру, связывающий CENP-B и формирующий активную центромеру, и alpha21-II, не имеющий регулярной структуры, ПЕВП, и содержащий включения неальфоидных последовательностей, например, дисперсных повторов ( рис 4 каз ). Детальный анализ альфа- сателлитных повторов локуса alpha21-II был проведен с использованием последовательности космидного клона pIA1 [ Mashkova et al., 1998 ]. Этот клон содержит вставку длиной около 37 т. н. п., из которых около 17 т. н. п. составляют альфа-сателлиты и около 20 т. н. п. - последовательности неальфоидной природы. Альфоидная часть космидного клона состоит из 100 мономеров, 88 из которых - полные и 12 - неполные. В альфа-сателлитной части обнаружено пять крупных делеций, нарушающих регулярную структуру альфа-сателлитов и три инсерции повторов типа L1 .
Все мономеры относятся к надхромосомному семейству 4 . Анализ нарушений регулярности выявил три альфа-сателлитных субдомена, один из которых содержит последовательности, сходные по структуре с последовательностями клонов pN [ Ikeno et al., 1994 ], второй - сходные с последовательностью клона pTRA-4 [ Vissel, Choo, 1992 ] и третий - сходные с последовательностями, локализованными на хромосоме 7 в области границы альфа-сателлитов и последовательностей неальфоидной природы [ Wevrick et al., 1992 ]. Исследование последовательности космидного клона pIA1 показало, что на границе альфоидного домена неравный кроссинговер, обеспечивающий гомогенизацию, менее эффективен, чем в середине домена, что приводит к сохранению интегрировавших в альфа- сателлит дисперсных повторов, а также "следов" рекомбинационных событий, нарушающих регулярную структуру сателлитных повторов.
Детальное исследование космидных клонов из библиотек, специфичных к хромосомам 13 и 21 методом FISH было проведено в лаборатории цитогенетики НЦПЗ РАМН под руководством Ю. Б. Юрова [ Soloviev et al., 1995 ; Соловьев и др., 1998 ]. В ходе этого исследования было показано, что клоны, содержащие альфа-сателлиты, можно разделить на две группы:
во-первых, клоны, локализованные в области первичной перетяжки,
во-вторых, клоны, локализованные в проксимальной части коротких плеч. Клоны первой группы даже в условиях высокой жесткости гибридизуются с обоими хромосомами и содержат альфа-сателлиты надхромосомного семейства 2 (установлено по минорным участкам гибридизации), то есть соответствуют альфа-сателлитам локуса alpha21-I. Клоны второй группы часто перекрестно гибридизуются со всеми акроцентрическими хромосомами и хромосомой Y, то есть содержат альфа-сателлиты надхромосомных семейств 4 и нхс 5 . Также многие клоны этого пула дисперсно гибридизуются с эухроматиновыми районами, что свидетельствует о наличии в них последовательностей неальфоидной природы. Это характерно для последовательностей локуса alpha21-II. По аналогии с термином alpha21-II [ Ikeno et al., 1994 ], авторы предложили ввести обозначение alpha13-I для обозначения локуса, локализованного в области первичной перетяжки, содержащего альфа-сателлиты надхромосомного семейства 2 ( локус D13Z1 ), имеющие регулярную структуру, и формирующие активную центромеру, и alpha13-II для обозначения локуса, локализованного в проксимальной части короткого плеча хромосомы 13 и содержащего альфа-сателлиты надхромосомного семейства 4, не имеющие ПЕВП и не связывающие CENP-B ( рис 4 каз ).
В той же работе было показано, что альфоидные последовательности из локусов alpha13-II и alpha 21-II отcутствуют в митотически стабильных маркерных хромосомах с делетированными короткими плечами, робертсоновских транслокациях t(13q;21q) и хромосомах 21р-. Таким образом, по-видимому эти последовательности не выполняют центромерную функцию.
