GlcCer: влияние на развитие нейронов в культуре гиппокампа
В начальных исследованиях лаборатории Футермана культура нейронов гиппокампа инкубировалась с FB1 со второго дня и длина аксона определялась на третий день. Значительного увеличения длины аксона не наблюдалось между вторым и третьим днями инкубации с FB1, в то время как аксоны в контроле удлинялись примерно на 70 мкм [ Harel, R., and Futerman, A. H. 1993 ].
Это явилось первой демонстрацией того, что рост аксонов может регулироваться синтезом SL в первичной культуре нейронов, хотя в более раннем исследовании был обнаружен ингибиторный эффект D-PDMP - ингибитора синтеза GlcCer - на рост нейритов в клетках нейробластомы мыши [ Uemura, К., Sugiyama, E.,ea., 1991 ], а позднее было показано, что рост дендритов может также ингибироваться FB1 в другом типе клеток [ Fiiruya, S., Ono, K.,ea., 1995 ].
Впоследствии мы продемонстрировали, что D-PDMP также блокирует рост аксонов в нейронах гиппокампа и что влияние инкубации с D-PDMP было неотличимо от эффекта FBI [ Schwarz, A., Rapaport, E.,ea., 1995 ].
Статистический анализ различных параметров нейронального роста наводит на мысль, что образование или стабилизация новых коллатеральных аксональных ветвей особенно чувствительны к манипулированию синтеза SL и это является специфическим аспектом роста нейронов, зависящего от синтеза SL.
В противоположность действию D-PDMP и FB1 инкубация с кондуритол В-эпоксидом ( СВЕ - ингибитор расщепления GlcCer ) стимулирует рост аксонов с повышением либо скорости образования, либо стабилизации аксональных ветвей. Стимулирующий эффект СВЕ может быть полностью упразднен коинкубацией с FB1 [ Schwarz, A., Rapaport, E.,ea., 1995 ] или с N-бутилдезоксиноиримицином (Шварц и Футерман, неопубликованные данные).
Это означает, что способность СВЕ увеличивать рост аксонов является результатом накопления вновь синтезированного GSL или GlcCer .
Неизвестно, требуется ли синтез высших GSL (т.е. ганглиозидов ) для роста аксонов или достаточно одного GSL, в частности GlcCer . Однако очевидно, что уменьшение скорости роста аксонов при ингибировании синтеза GSL не связано с уменьшением общей массы GSL или GlcCer, поскольку короткая инкубация с ингибиторами (3-6 ч) способна ингибировать рост.
Вероятно, замедление аксонального роста прямо связано с синтезом и доставкой вновь синтезированных GSL из ER и аппарата Гольджи к аксональным мембранам [ Futerman, A. H., and Banker, G. A. 1996 ]. Дальнейшие исследования, проведенные в середине 90-х гг, показали, что протекание синтеза GlcCer требуется для роста аксона в период стадии 3 [ Schwarz, A., and Futerman, A. H. 1997 ] и для ускорения аксонального роста при инкубации с ростовыми факторами [ Boldin, S., and Futerman, A. H. 1997 ].
Это было показано при использовании ламинина и основного ростового фактора фибробластов [ Boldin, S., and Futerman, A. H. 1997 ]. Как первый, так и второй стимулируют рост аксонов примерно в 4 раза. Удивительно, что стимулирующий эффект обоих факторов может быть полностью устранен FB1 или D-PMDP.
Однако добавление производного церамида с короткой ацильной цепью - C#6-NBD-D-erythro-церамида вместе с FB1 противодействует ингибиторному действию FB1 на рост, стимулированный bFGF .
В противоположность этому другой стереоизомер церамида - С#6-NBD-L-threo-церамид - оказался совершенно неэффективным в противодействии влиянию FB1.
Анализ метаболизма стереоизомеров с помощью ТСХ показал, что примерно 10-15% C#6-NBD-D-erythro-церамида превращается в C#6-NBD-D-erythro-GlcCer в течение 3 ч инкубации, в то время как С#6-NBD-L-threo-церамид не метаболизирует совсем [ Boldin, S., and Futerman, A. H. 1997 ].
Наряду с наблюдениями, что ни C#6-NBD-D-erythro-церамид, ни С#6-NBD-L-threo-церамид не способны противодействовать ингибиторному эффекту D-PDMP на рост, стимулированный bFGF, эти данные показывают, что способность bFGF и ламинина стимулировать рост аксонов требует протекания синтеза GlcCer из церамида .
Эти данные также демонстрируют, что способность экзогенно добавленного церамида противодействовать ингибиторному эффекту FB1 не обусловлена активацией сигнального пути, проводимого церамидами (см. ниже), поскольку как D-erythro-церамид, так и L-threo-церамид в равной степени эффективны в проведении сигнала [ Bielawska, A., Crane, H. M.,ea., 1993 , Fishbein, J. D., Dobrowsky, R. Т.,ea., 1993 ], но только C#6-NBD-D-erythro-церамид обладает способностью противодействовать влиянию FB1.
C#6-NBD-D-erythro-церамид метаболизирует только в C#6-NBD-D-erythro-GlcCer, но не в более сложные GSL в культуре нейронов гиппокампа [ Harel, R., and Futerman, A. H. 1993 , Boldin, S., and Futerman, A. H. 1997 ]. Это свидетельствует о том, что протекание синтеза GlcCer (но не более сложных GSL) требуется для стимуляции роста аксонов bFGF.
Две возможности могут объяснить необходимость синтеза GlcCer для роста аксонов.
Во-первых, GlcCer может требоваться для ламинина и bFGF, чтобы передать сигнал после их связывания с рецепторами на клеточной поверхности. Однако эта возможность маловероятна, поскольку уровень GlcCer на поверхности клетки существенно не меняется в течение 3 ч инкубации с FB1 или с D-PDMP [ Schwarz, A., Rapaport, E.,ea., 1995 ].
Вторая возможность - это требование протекания синтеза GlcCer обусловлено необходимостью непрерывного переноса вновь синтезированного GlcCer от места синтеза в растущую аксональную мембрану. При этом сценарии требование синтеза GlcCer может быть отнесено к событиям, происходящим в местах его синтеза, или альтернативно к событиям, происходящим на РМ после включения GlcCer в РМ. Ингибирование синтеза GlcCer может прямо влиять на образование пузырьков в аппарате Гольджи , если GlcCer является компонентом, лимитирующим скорость образования этих пузырьков. Однако недавние исследования показали, что D-PDMP не влияет на включение C#6-NBD-D-erythro-церамид в везикулы, образованные аппаратом Гольджи в нейронах гиппокампа, и что C#6-NBD-L-threo-цepaмид также включается в эти везикулы (Барек, Бенкер, Футерман, неопубликованные данные), хотя только C#6-NBD-D-erythro-Cer метаболизирует в GlcCer и способен противодействовать ингибиторному влиянию FB1 на рост аксонов.
Альтернативно, синтез GlcCer может требоваться для транспорта, сортинга или включения в везикулы аппарата Гольджи ключевого белка, который участвует в регуляции роста аксонов . В СНО-клетках ингибирование синтеза GlcCer блокирует доставку вирусного белка к клеточной поверхности [ Rosenwald, A. G., Machamer, C. E.,ea., 1992 ], хотя этот эффект позднее был отнесен к аккумулированию церамида [ Rosenwald, A. G., and Pagano, R. E. 1993 , Chen, С. S., Rosenwald, A. G.,ea., 1995 ], а не к истощению GlcCer. Это не может быть причиной нарушения роста аксонов, наблюдаемого в нейронах гиппокампа, поскольку экзогенно добавленные церамиды не нарушают рост на этой стадии развития и церамиды должны метаболизироваться в GlcCer для поддержания роста.
Весьма вероятно, что стимуляция аксональных выростов bFGF, либо ламинином активировирует синтез GlcCer, предполагая, что синтез GlcCer является скорость-лимитирующей стадией роста аксонов. Предварительные данные показывают, что скорость синтеза GlcCer увеличивается примерно в 2 раза in vivo при инкубации нейронов гиппокампа с bFGF или с ламинином.
Это означает, что GlcCer-синтаза является регулируемым ферментом. Более того, поскольку регуляция ферментативной активности происходит в короткий временной период, она должна быть после трансляции, а не при увеличенной регуляции синтеза белка, как было ранее обнаружено для GlcCer-синтазы при определенных условиях [ Abe, A., Radin, N. S.,ea., 1996 , Sando, G., Howard, E. J.,ea., 1996 ].
Инкубация с циклогексимидом (который ингибирует белковый синтез) или брефельдином А (который разрушает аппарат Гольджи и, следовательно, ингибирует движение везикул, образующихся в аппарате Гольджи) блокирует способность bFGF или ламинина стимулировать рост аксонов (Болдин, Футерман, неопубликованные данные), хотя причиной этого блокирования, видимо, является уменьшение всей массы мембранных компонентов, а не специфического липида, как это происходит в случае инкубации с FB1 или с D-PDMP.
Таким образом, протекание синтеза GlcCer в ранних участках аппарата Гольджи необходимо для нормального и ускоренного роста аксонов. Этот эффект весьма отчетлив и далее будет показано, что церамиды, продуцируемые при расщеплении SM , участвуют в регуляции на ранней стадии развития нейрона. Следовательно, при разных стадиях нейронального развития вновь синтезированный церамид по своему значению отличается от церамида, образованного деструкцией SM.
